Кишкова паличка (Escherichia coli), ГКЛ, ОКХ, ТКЛ. Загальне мікробне число для питної води

8.1. Визначення загальної кількості мікроорганізмів, що утворюють колонії на живильному агарі

8.1.1. Визначення поняття показника

Метод визначає у питній воді загальне числомезофільних аеробних та факультативно анаеробних мікроорганізмів (ОМЧ), здатних утворювати колонії на живильному агарі при температурі 37 °С протягом 24 год, видимі зі збільшенням у 2 рази.

8.1.2. Виконання аналізу

З кожної проби роблять посів щонайменше двох обсягів по 1 мл.

Після ретельного перемішування проби води вносять по 1 мл у стерильні чашки Петрі, злегка відкриваючи кришки. Після внесення води в кожну чашку вливають (8-12) мл (на чашку діаметром 90-100 мм) розплавленого і остудженого до (45-49) °С живильного агару після фламбування краю посуду, в якому він міститься. Потім швидко змішують вміст чашок, рівномірно розподіляючи по всьому дну, уникаючи утворення бульбашок повітря, попадання агару на краї та кришку чашки. Цю процедуру роблять на горизонтальній поверхні, де чашки залишають до застигання агару.

Розплавлений агар на період проведення аналізу поміщають у водяну баню або термостат, що підтримують температуру (45-49) °З.

Після застигання агару чашки з посівами поміщають у термостат догори дном і інкубують при температурі (37±1)°С протягом (24±2) год.

8.1.3. Облік результатів

Підраховують всі, що виросли на чашці колонії, що спостерігаються при збільшенні в 2 рази. Враховують ті чашки, у яких виросло трохи більше 300 ізольованих колоній.

Кількість колоній на обох чашках підсумовують і поділяють на дві. Результат виражають числом колонієутворюючих одиниць (КОЕ) в 1 мл досліджуваної проби води.

Якщо на одній із двох чашок підрахунок неможливий, результат видають на підставі обліку колоній на одній чашці. Якщо на двох чашках має місце зростання розпливчастих колоній, що не розповсюджується на всю поверхню чашки, або зросло більше 300 колоній і аналіз не можна повторити, підраховують сектор чашки з наступним перерахуванням на всю поверхню. У цих випадках у протоколі відзначають "число КУО/мл - орієнтовно".

Якщо підрахунок колоній на чашках неможливий, то протоколі зазначають “суцільне зростання”.

8.2. Визначення загальних та термотолерантних коліформних бактерій методом мембранної фільтрації (основний метод)

8.2.1. Визначення поняття показника

Загальні коліформні бактерії (ОКБ) - грамнегативні, оксида-зонегативні, не утворюють спор палички, здатні рости на диференціальних лактозних середовищах, що ферментують лактозу до кислоти, альдегіду та газу при температурі (37 ± 1) °С протягом (24-48) .

Термотолерантні коліформні бактерії (ТКБ) входять до числа загальних коліформних бактерій, мають всі їхні ознаки і, крім того, здатні ферментувати лактозу до кислоти, альдегіду і газу при температурі (44 ± 0,5) °С протягом 24 год.

8.2.2. Принцип методу

Метод заснований на фільтрації встановленого об'єму води через мембранні фільтри, вирощуванні посівів на диференціальному поживному середовищі з лактозою та подальшій ідентифікації колоній за культуральними та біохімічними властивостями.

8.2.3. Виконання аналізу

8.2.3.1. Порядок дослідження

При дослідженні питної води аналізують 3 об'єми 100 мл.

При отриманні стабільних негативних результатів допустима фільтрація 300 мл води через фільтр.

При фільтрації води невідомої якості доцільно збільшення кількості об'ємів, що фільтруються, для отримання ізольованих колоній на фільтрі (наприклад, 10, 40, 100, 150 мл води).

Відмірений обсяг води фільтрують через мембранні фільтри з дотриманням вимог, викладених у п. 7.

Фільтри поміщають на середовище Ендо, приготоване за п. 5.4. Чашки з фільтрами ставлять термостат дном вгору і інкубують посіви при температурі (37 ± 1) °С протягом (24 ± 2) год.

Якщо на фільтрах немає зростання або виросли колонії плівчасті, губчасті, плісняві, прозорі, розпливчасті, видають негативну відповідь: відсутність ОКБ та ТКБ у 100 мл досліджуваної води. Аналіз закінчують через 24 год.

Якщо на фільтрах виявлено зростання ізольованих типових лакто-позитивних колоній: темно-червоних, червоних з металевим блиском або без нього або інших подібного типу колоній з відбитком на звороті фільтра, підраховують кількість колоній кожного типу окремо і приступають до підтвердження їх приналежності до ОКБ та ТКЛ.

Для підтвердження наявності ОКБ досліджують:

Усі колонії, якщо на фільтрах виросло менше 5 колоній;

Щонайменше 3-4 колоній кожного типу.

На підтвердження наявності ТКБ досліджують всі типові колонії, але з більше 10.

Кожну обрану ізольовану колонію досліджують на:

Наявність оксидазної активності;

Приналежність до Граму (мікроскопія забарвленого за Грамом препарату або постановка тіста Грегерсена);

Ферментацію лактози до кислоти та газу.

8.2.3.2. Постановка оксидазного тіста

Смужку фільтрувального паперу поміщають у чисту чашку Петрі та змочують 2-3 краплями реактиву для оксидазного тіста за п. 5.7. Готові паперові системи змочують дистильованою водою. Частину ізольованої колонії скляною папочкою або платиновою петлею (металева петля з ніхрому може дати хибнопозитивну реакцію) наносять штрихом на підготовлений фільтрувальний папір. Реакція вважається позитивною, якщо протягом 1 хв з'являється фіолетово-коричневе (п. 5.7.1 варіант 1) або синє (п. 5.7.2 варіант 2 та СІБ-оксидаза) забарвлення штриха. При негативній реакції колір у місці нанесення культури не змінюється. За позитивного результату цю колонію з подальшого дослідження виключають.

Якщо при дослідженні колоній, забарвлених у темно-червоний колір, одержують недостатньо чіткий результат, необхідно пересіяти культуру з середовища Ендо на живильний агар. Після інкубації повторюють тест.

8.2.3.3. Визначення приналежності до Граму

З оксидазоотрицательной колонії робиться мазок, забарвлюється за Грамом і мікроскопується.

На знежирене спиртом предметне скло наносять петлею 1 краплю дистильованої води, вносять невелику кількість культури з колонії, що аналізується, і розподіляють по поверхні скла. Мазок висушують за кімнатної температури і фіксують трикратним проведенням через полум'я пальника. На препарат накладають смужку фільтрувального паперу і на неї наливають карболовий розчин фіолетового генціану на (0,5-1) хв, знімають папір, наливають розчин Люголя на (0,5-1) хв, зливають розчин Люголя і скло промивають в етиловому спиртіпротягом (0,5-1) хв, поки не перестане відходити барвник. Потім скло ретельно промивають водою і дофарбовують протягом (1-2) хв фуксином Цилю, розведеним 1:10 дистильованою водою. Після промивання та просушування препарату мазок мікроскопують.

Приготування реактивів для фарбування за Грамом викладено у п. 5.9.

Грамнегативні мікроорганізми мають рожеве забарвлення, грампозитивні забарвлюються в синій колір. Коліформні бактерії є грамнегативними паличками.

Забарвлення за Грамом може бути замінене тестом Грегерсена, що не вимагає використання оптики.

Тест Грегерсена: у краплі 3% водного розчину КОН на предметному склі емульгують бактерійну масу, взяту з щільного середовища. Після кількох секунд перемішування петлею завись ослизняется і за петлею тягнуться слизові нитки, що вказує на належність випробуваної культури або колонії до грамнегативного вигляду. У грампозитивних бактерій слизові нитки не утворюються – реакція негативна.

8.2.3.4. Визначення ферментації лактози

Решту оксидазонегативної грамнегативної ізольованої колонії засівають паралельно в дві пробірки з лактозним середовищем (п. 5.6):

Для підтвердження наявності ОКБ посів інкубують за температури (37 ± 1) °С протягом 48 год;

Для підтвердження наявності ТКБ посів здійснюють у середу, попередньо прогріту до температури (43-44) °З, і інкубують при температурі (44 ± 0,5) °З протягом 24 год.

Первинний облік утворення кислоти і газу на напіврідких середовищах, що підтверджують, і СІБ (п. 5.6) можливий через (4-6) ч. При виявленні кислоти і газу дають позитивну відповідь. За відсутності кислоти і газу або за наявності тільки кислоти пробірки з посівами для остаточного обліку ТКБ залишають до 24 год.

Якщо колонія, що підлягає дослідженню, незначних розмірів, її пересівають на скошений живильний агар і після інкубації (18-24) год виконують всі необхідні підтверджуючі тести.

8.2.3.5. Постановка підтверджуючих тестів при накладенні колоній або суцільному зростанні

Якщо на частині або на всій поверхні фільтра спостерігається накладення колоній або суцільне зростання, виконують оксидазний тест шляхом приміщення мембранного фільтра на кружок фільтрувального паперу більшого діаметру, ніж фільтр, рясно змочений реактивом, або диск СІБ-оксидаза, змочений дистильованою водою. З появою перших ознак реакції, але не більше ніж через 5 хв, мембранний фільтр переносять назад на середовище Ендо. Після чіткого прояву реакції визначають результат. З появою фіолетово-коричневого або синього фарбування (залежно від застосованого реактиву) оксидазний тест вважають позитивним.

Якщо на фільтрах всі колонії оксидазопозитивні, вони не враховуються та видають відповідь про відсутність ОКБ та ТКЛ та завершують аналіз.

При негативній оксидазної реакції проводять розсівання до отримання ізольованих колоній і підтверджують їх належність до ОКБ та ТКБ за п. п. 8.2.3.3-8.2.3.4 (якісний аналіз).

8.2.4. Облік результатів

8.2.4.1. Грамнегативні колонії враховуються як ОКБ при негативному оксидазному тесті та ферментації лактози при температурі 37 ° С з утворенням кислоти та газу.

Грамнегативні колонії враховуються як ТКБ при негативному оксидазному тесті та ферментації лактози при температурі 44 °С з утворенням кислоти та газу.

8.2.4.2. За відсутності загальних і термотолерантних коліформних бактерій на всіх фільтрах результат записують "не виявлено ДЕЯ ОКБ в 100 мл" і "не виявлено ДЕЯ ТКБ в 100 мл".

8.2.4.3. У разі ідентифікації всіх підозрілих колоній, що виросли, число колонієутворюючих одиниць ОКБ і ТКБ підраховують на всіх фільтрах і виражають результат аналізу КУО в 100 мл води.

Обчислення проводять за такою формулою:

Х-число колоній 100 мл;

профільтрований обсяг води через фільтри, на яких вівся облік;

а - число підрахованих цих фільтрах колоній у сумі.

1. При посіві 3 фільтрів по 100 мл виросло дві колонії в 100 мл, інших двох фільтрах немає зростання. Кількість загальних або термотолерантних коліформних бактерій буде:

ДЕЯНО ОКБ (ТКБ) в 100 мл

2. При посіві 10, 40, 100 та 150 мл на фільтрах з профільтрованим об'ємом 40 мл виросло 4 ізольовані колонії, з профільтрованим об'ємом 100-3 ОКБ. Фільтри з об'ємами 10 мл та 150 мл зарості та обліку не підлягають. Підсумовують загальну кількість колоній ОКБ (ТКБ) на тих фільтрах, де отримані ізольовані колонії, та перераховують на об'єм 100 мл.

ЩЕ в 100 мл

8.2.4.4. Якщо при вибірковій перевірці колоній одного типу отримані різні результати, то обчислюють числа ОКБ або ТКБ серед колоній цього типу за формулою:

, де

Х – число підтверджених бактерій одного типу;

а – загальна кількість колоній цього типу;

- Число перевірених з них;

с – число колоній з позитивним результатом.

Отримані результати обліку щодо кожного типу колоній підсумовують і далі підраховують за п. 8.2.4.3-8.2.4.4.

8.2.4.5. Остаточний результат видають: кількість КУО ОКБ в 100 мл, їх кількість КУО ТКБ в 100 мл.

Орієнтовний результат може бути виданий при виявленні типових коліформних колоній на середовищі Ендо, утворених грамнегативними оксидазонегативними бактеріями. Остаточна відповідь підтверджується результатами ферментації лактози.

8.2.4.6. При накладенні колоній або суцільному зростанні на всіх фільтрах (п. 8.2.3.5) у разі підтвердження належності до ОКБ та ТКБ видається якісний результат “виявлено ОКБ у 100 мл”.

Якщо всі колонії на фільтрі оксидазопозитивні або не підтвердилася їх приналежність до ОКБ та ТКБ, аналіз завершується, у протоколі зазначають “зариє фільтрів”.

В обох випадках повторюють аналіз.

8.3. Визначення загальних та термотолетарних коліформних бактерій титраційним методом

8.3.1. Визначення поняття показника

Визначення поняття показників ОКБ та ТКЛ за п. 8.2.1.

8.3.2. Галузь застосування

Титраційний метод може бути використаний:

За відсутності матеріалів та обладнання, необхідних для виконання аналізу методом мембранної фільтрації;

При аналізі води з великим вмістом завислих речовин;

У разі переважання у воді сторонньої мікрофлори, що перешкоджає одержанню на фільтрах ізольованих колоній загальних коліформних бактерій.

8.3.3. Принцип методу

Метод заснований на накопиченні бактерій після посіву встановленого об'єму води в рідке живильне середовище, з наступним пересіванням на диференціальне щільне живильне середовище з лактозою та ідентифікації колоній з культуральних та біохімічних тестів.

8.3.4. Виконання аналізу

При дослідженні питної води якісним методом(поточний санепіднагляд, виробничий контроль) засівають 3 об'єми по 100 мл.

При дослідженнях води з метою кількісного визначенняОКБ і ТКБ при повторному аналізі виробляють посів: 3 об'єми по 100 мл, 3 об'єми по 10 мл, 3 об'єми по 1 мл.

Кожен обсяг досліджуваної води засівають у лактозо-пептонне середовище, приготовлене за п.5.5. Посів 100 мл і 10 мл води виробляють в 10 і 1 мл концентрованого лактозо-пептонного середовища, посів 1 мл проби проводять у 10 мл середовища звичайної концентрації.

Посіви інкубують при (37 ± 1) °С протягом 48 год. Не раніше 24 год. інкубації проводять попередню оцінку посівів. З ємностей, де зазначено наявність зростання (помутніння) та утворення газу, виробляють висів бактеріологічної петлею на сектори середовища Ендо (п. 5.4.1) для отримання ізольованих колоній.

Ємності без наявності зростання та утворення газу залишають у термостаті та остаточно переглядають через 48 год. Посіви без ознак зростання вважають негативними та подальшому дослідженню вони не підлягають. З ємностей, де відзначено помутніння та утворення газу або тільки помутніння, роблять висів на сектори середовища Ендо.

Посіви на середовищі Ендо інкубують за температури (37 ± 1) °С протягом (18-20) год.

При утворенні помутніння і газу в середовищі накопичення та зростанні на середовищі Ендо колоній, типових для лактозопозитивних бактерій: темно-червоних або червоних, з металевим блиском або без нього, опуклих з червоним центром і відбитком на живильному середовищі, дають позитивну відповідь на присутність загальних колиформ бактерій у цьому обсязі проби.

Наявність ОКБ потрібно підтвердити:

Якщо серед накопичення відзначено лише помутніння;

Якщо приналежність до лактозопозитивним колоніям викликає сумнів у дослідника. У таких випадках:

Перевіряють наявність відбитка на середовищі Ендо після зняття петлею підозрілої колонії;

Виконують оксидазний тест за п. 8.2.3.2;

Підтверджують належність до Грама за п. 8.2.3.3;

Підтверджують здатність до газоутворення при посіві ізольованих 1-2 колоній кожного типу з кожного сектора на середовище з лактозою за п. 5.6 з подальшою інкубацією посівів при температурі (37 ± 1) °C протягом (24-48) год.

За відсутності ізольованих колоній проводять розсівання на середовище Ендо загальноприйнятими бактеріологічними методами.

Негативну відповідь дають, якщо:

Серед накопичення немає ознак зростання;

На секторах середовища Ендо немає зростання;

На секторах середовища Ендо виросли не характерні для коліформних бактерій колонії (прозорі з нерівними краями, розпливчасті тощо);

Усі колонії виявилися оксидазопозитивними;

Всі колонії виявилися грампозитивними;

Якщо у підтвердному тесті на середовищі з вуглеводом немає газоутворення.

Для визначення термотолерантних коліформних бактерійпрацюють із секторами середовища Ендо, де виросли типові лактозопозитивні колонії. Роблять посів 2-3 ізольованих колоній кожного типу з кожного сектора в пробірки з будь-яким із лактозних середовищ, приготовлених за п. 5.6.

Середовище перед посівом нагрівають на водяній бані або термостаті до 44 °С. Негайно після посіву пробірки поміщають у термостат та інкубують при температурі (44 ± 0,5) °С протягом 24 год. Допускається перегляд посівів через (4-6) год.

При утворенні газу в середовищі накопичення, зростанні на середовищі Ендо лактозопозитивних бактерій та виявленні здатності цих бактерій ферментувати лактозу до кислоти та газу протягом 24 годин при температурі 44 °С дають позитивну відповідь на наявність у цьому обсязі проби води ТКЛ. У решті випадків дають негативну відповідь.

Допустимо для прискорення видачі відповіді на присутність ТКБ проводити висів 1 мл з обсягів середовища накопичення, де відзначено помутніння і газоутворення в пробірці з лактозо-пептонним середовищем з поплавцем за п. 5.6 і попередньо прогрітий до температури 44 °С. Посіви витримують у термостаті при температурі (44±0,5)°С протягом 24 год. При виявленні кислоти та газу дають позитивну відповідь.

8.3.5. Облік результатів

При дослідженні 3 обсягів по 100 мл результати оцінюються якісно і за виявленні ОКБ і ТКБ хоча у одному з 3 обсягів, робиться запис у протоколі “виявлено 100 мл”.

При дослідженні кількісним методом визначають найбільш ймовірне число (НВЧ) ОКХ та ТКЛ за табл. 1.1 додатки 1.

Результати повідомляють без довірчого інтервалу.

При негативному відповіді наявність ОКБ і ТКБ переважають у всіх досліджених обсягах видають висновок у протоколі “не виявлено 100 мл”.

8.4. Визначення суперечок сульфітредукуючих клостридій

8.4.1. Визначення поняття показника

Сульфітредукуючі клостридії - спороутворюючі анаеробні паличкоподібні мікроорганізми, що редукують сульфіт натрію на залізо-сульфітному агарі при температурі (44 ± 1) °С протягом (16-18) год.

8.4.2. Принцип методу

Метод заснований на вирощуванні посівів у залізо-сульфітному агарі в умовах, наближених до анаеробних, та підрахунку числа чорних колоній.

8.4.3. Виконання аналізу

8.4.3.1. Пробу води 20 мл прогрівають на водяній бані в пробірках при температурі (75±5)°С протягом 15 хв для виключення вегетативних форм.

При дослідженні хлорованої води прогрівання проби можна проводити.

З кожної проби питної води роблять сівбу або фільтрують 20 мл. При необхідності підбирають обсяги з таким розрахунком, щоб у посівах (на фільтрах) зросло трохи більше 10-15 колоній. У цьому орієнтуються результати попередніх досліджень.

Фільтрування води проводять відповідно до вимог, викладених у п. 7.

8.4.3.2. Визначення методом фільтрування у пробірках

Перед посівом пробірки із залізосульфітним агаром, приготованим по 5.8, розплавляють на водяній бані (не кип'ятити!). Протягом посіву підтримують нагріте середовище до (70-80) °С у водяній бані.

Після фільтрування встановленого об'єму води мембранний фільтр фламбованим пінцетом беруть за два протилежні краї і зігнутий у вигляді трубочки поміщають у пробірку з гарячим агаром. Сторона фільтра з бактеріями, що осіли, звернена всередину. При цьому фільтр розпрямляється та розташовується по стінці пробірки.

Відразу після посіву пробірку з агаром, і фільтром для створення анаеробних умов швидко охолоджують, поміщаючи в ємність з холодною водою. Культивують посіви при (44±I) °С протягом (16-18) год.

8.4.3.3. Визначення методом фільтрування у чашках Петрі

Чашки Петрі діаметром (55-60) мм заливають тонким шаром залізо-сульфітного агару. Після фільтрації фільтр помістити поверхнею, що фільтрує, вниз на застигле поживне середовище так, щоб під фільтром не було бульбашок повітря. Потім заливають розплавленим залізосульфітним агаром до верхнього краю чашки, щоб кришка щільно прилягала до середовища для створення анаеробних умов. Культивують посіви за (44 ± 1) °С протягом (16 - 1 8) год.

8.4.3.4. Визначення прямим посівом

Залізо-сульфітний агар у флаконах та пробу води готують, як описано в п. 8.4.3.1.

У стерильні пробірки вносять:

По 10 мл у 2 пробірки (об'ємом не менше 30 мл) або

По 5 мл у 4 пробірки (об'ємом по 15 мл).

Посіви заливають гарячим залізосульфітним агаром у кількості, що перевищує об'єм води в 2 рази. Середовище заливати по стінці пробірки, уникаючи утворення бульбашок повітря. Після цього пробірку швидко охолоджують, поміщаючи її в ємність холодною водою для створення анаеробних умов. Посіви інкубують за (44 ± 1) °С протягом (16-18) год.

8.4.4. Облік результатів

Кількісному обліку підлягають ті посіви, де отримані ізольовані колонії. Підраховують чорні колонії, що виросли як на фільтрах, так і в товщі живильного середовища.

Результат аналізу виражають числом колонієутворюючих одиниць (КОЕ) спор сульфітредукуючих клостридій в 20 мл води.

За відсутності зростання чорних колоній усім фільтрах дають відповідь “не виявлено 20 мл води”.

При неможливості обліку колоній через зливне зростання результат оцінюється як якісний, у протоколі зазначають "виявлено в 20 мл". При необхідності отримання кількісного результату повторюють аналіз.

8.5. Визначення коліфагів

8.5.1. Визначення поняття показника

Коліфаги - бактеріальні віруси, здатні лізувати Е. coli і формувати при температурі (37 ± 1) ° С через (18 ± 2) год зони лізису бактеріального газону (бляшки) на живильному агарі.

8.5.2. Титраційний метод визначення коліфагів

8.5.2.1. Принцип методу

Визначення коліфагів у питній воді полягає у попередньому накопиченні коліфагів у середовищі збагачення на культурі Е. coli та подальшому виявленні зон лізису (просвітлення) газону Е. coli на живильному агарі.

8.5.2.2. Галузь застосування

Метод призначений для проведення поточного контролюякості питної води

8.5.2.3. Підготовка тест-культур Е. coli K12 StrR.

На всіх етапах дослідження використовують бактеріальну суспензію, приготовлену наступним чином: культуру Е. coli засівають у пробірку зі скошеним поживним агаром зі стрептоміцином (п. 5.3.5). Через (18 ±2) год інкубації при температурі (37±1)°З зробити змив бактерій з косяка 5 мл стерильного фізіологічного розчину (0,85 %-ний розчин NaCl) і за стандартом каламутності готують завис Е. coli в концентрації 109 бактеріальних клітин на 1 мл.

Допускається використання 4-годинної бульйонної культури Е. coli, отриманої шляхом підрощування термостату при температурі 37°С. Концентрація 109 бактеріальних клітин Е. coli міститься 2 мл.

8.5.2.4. Проведення якісного аналізу

У досліджувану пробу води об'ємом 100 мл вносять 10 мл 10-кратного поживного бульйону (приготовленого за п. 5.2.2) та 1 мл підготовленого змиву тест-культури або 2 мл 4-годинної бульйонної культури (п. 8.5.2.3).

Для контролю культури 0,1 мл змиву бактерій Е. coli (або 0,2 мл 4-годинної бульйонної культури) поміщають у чашку Петрі та заливають поживним агаром.

Досліджувану пробу води (100мл) і чашку Петрі з контролем Е. coli поміщають у термостат та інкубують при температурі (37±1)°С протягом (18±2) год.

Після інкубації з досліджуваної проби води відливають пробірку 10 мл і додають 1 мл хлороформу.

Пробірку закривають стерильною гумовою або силіконовою пробкою, енергійно струшують для рівномірного розподілу хлороформу за обсягом проби і залишають при кімнатній температурі не менше ніж 15 хв до осадження хлороформу.

У попередньо розплавлений і остуджений до (45-49) °Спитательний агар додають приготовлений змив бактерій Е. coli (п. 8.5.2.3) з розрахунку 1,0 мл змиву (або 2 мл 4-годинної бульйонної культури) на 100 мл агару.

У стерильну чашку Петрі піпеткою з пробірки переносять 1 мл обробленої хлороформом проби (не торкаючись хлороформу) і заливають сумішшю розплавленого і остудженого до (45-49) °С живильного агару об'ємом. (12-15) мл, а також одну додаткову чашку Петрі культури Е. coli та обережно похитують для рівномірного перемішування проби води та агару. Для повного застигання чашки залишають на столі за кімнатної температури на 10 хв. Після застигання чашки перевертають і поміщають у термостат (18 ± 2) год при 37 °С.

Під час виконання серії проб ставиться загальний контроль для всієї серії.

Облік результатів

Перегляд посівів здійснюють у світлі, що проходить.

Проба вважається позитивною за наявності повного лізису, просвітлення кількох бляшок, однієї бляшки на чашці із пробою води за відсутності зон лізису на контрольній чашці.

У протоколі аналізу зазначається: коліфаги виявлено або не виявлено в 100 мл води (результат якісний).

За наявності зон лізису у контролі культури результат вважається недійсним.

8.5.2.5. Проведення кількісного аналізу

Досліджувану пробу води у кількості 100 мл розлити на 6 об'ємів: 1 флакон 50 мл та 5 пробірок по 10 мл. У 50 мл проби додати 5 мл десятикратного поживного бульйону (за п. 5.2.2) та 0,5 мл змиву (або 1 мл 4-годинної бульйонної культури) бактерій Е. coli (п. 8.5.2.3). У кожні 10 мл проби внести по 1 мл десятикратного поживного бульйону та 0,1 мл змиву (або 0,2 мл 4-годинної бульйонної культури) бактерій Е. coli.

Для контролю культури ОД мл змиву бактерій (або 0,2 мл 4-годинної бульйонної культури) Е. coli поміщають у чашку Петрі та заливають поживним агаром.

Посіви інкубують при температурі (37±1) °С протягом 18±2год.

Після інкубації об'єму 50 мл відлити в пробірку 10 мл. У всі досліджувані 6 об'ємів додати 1 мл хлороформу. Пробірки закрити стерильними гумовими або силіконовими пробками, енергійно струсити для рівномірного розподілу хлороформу за обсягом проби і залишити при кімнатній температурі не менше 15 хв для осадження хлороформу.

У попередньо розплавлений і остуджений до (45-49) °С поживний агар додати приготовлений змив бактерій Е. coli (п. 8.5.2.3) з розрахунку 1,0 мл змиву (або 2 мл 4-годинної бульйонної культури) на 100 мл агару . Приготовлену суміш розлити в чашки Петрі: 1 чашку для контролю культури Е. coli на лізогенність і по одній чашці на кожну пробу води, що досліджується. При одночасному аналізі кількох спроб води ставиться один контроль культури Е. coli.

Після застигання агару чашки, призначені для посіву проб, розділити на 6 секторів, промаркувати їх відповідно до досліджуваних обсягів. На кожний сектор із відповідної пробірки нанести пастерівською піпеткою (мікропіпеткою або бактеріологічною петлею поздовжнім штрихом) по 1 краплі надосадової рідини (без хлороформу).

Після підсихання крапель чашки з пробами, що досліджуються, і контрольну чашку помістити в термостат при (37 ± 1) °С на (18 ± 2) год.

Облік результатів

Перегляд результатів здійснюється в світлі, що проходить.

Облік проводиться за наявністю зон просвітлення (лізису) на секторах газону Е. coli.

При застосуванні крапельного способу посіву піпеткою утворюється зона лізису у вигляді округлої плями або окремих бляшок. При посіві поздовжнім штрихом бактеріологічної петлею відзначається лізис у процесі штриха.

Проба вважається позитивною за наявності зони лізису хоча б на одному секторі за відсутності зон лізису на контрольній чашці.

Оцінка проводиться за таблицею найімовірнішого числа (НВЧ) бляшкоутворюючих одиниць (БОЕ) (табл. 1.2). У протоколі аналізу вказується найбільш імовірна кількість коліфагів у 100 мл води та діапазон можливих коливань: НВЧ БІЇ (нижня межа - верхня межа) коліфагів у 100 мл. Результат напівкількісний.

За наявності зон лізису у контрольній чашці результат вважати недійсним.

8.5.3. Прямий метод визначення коліфагів

.1. Принцип методу

Визначення коліфагів у питній воді полягає у дослідженні нормованого об'єму води (100 мл) шляхом його прямого посіву та подальшого обліку зон лізису (бляшок) на газоні Е. coli у чашках Петрі з живильним агаром.

8.5.3.2. Область визначення

Прямий метод виділення коліфагів з води проводять паралельно з титраційним при дослідженнях епідемічних показань.

8.5.3.3. Проведення аналізу

У поживний агар подвійної концентрації (п. 5.3.2), розплавлений і остуджений до (45-49) °С, додати змив Е. coli (п. 8.5.2.3) з розрахунку 2,0 мл змиву (або 4 мл 4- годинний бульйонної культури) на кожні 100 мл агару, перемішати. Досліджувані 100 мл води розлити по 20 мл у великі пробірки, нагріти до (35-44) °С і негайно (не більше ніж через 5 хв після досягнення необхідної температури) розлити в 5 чашок Петрі і відразу внести в кожну чашку по 20 мл суміші агару з культурою Е. соli.

Для контролю культури Е. coli в одну чашку Петрі внести 20 мл водопровідної стерильної води, попередньо прогрітої до (35-44) °С, залити 20 мл приготовленого агару з Е. coli і обережно перемішати.

Вміст чашок обережно перемішати та залишити при кімнатній температурі до застигання. Чашки із застиглим агаром помістити дном вгору в термостат і інкубувати при температурі (37±1) °С протягом (18±2) год.

Облік результатів

Перегляд посівів здійснюється в світлі, що проходить.

Облік результатів проводять шляхом підрахунку та підсумовування бляшок, що виросли на 5 чашках Петрі. Результати виражають у бляшко-утворюючих одиницях (БОЇ) на 100 мл проби води. У контрольній чашці бляшки повинні бути відсутніми.

Найчастіше зони лізису виглядають прозорими плямами на тлі газону тест-культури живильного агару у вигляді круглих ізольованих бляшок (від 1 до 5-7) мм у діаметрі з чітко вираженими або стертими межами.

При високих концентраціях фага спостерігається різна картиналізису.

Злиття негативних колоній дає "ажурний" газон Е. coli, зростання одиничних колоній Е. coli на тлі суцільного лізису або повна відсутність зростання на чашці.

При прямому посіві можливий лізис, що маскується негомогенно застиглим агаром, а також закритий супутньою мікрофлорою. Краплі конденсату і негомогенно застиглий агар можуть призводити до утворення артефактів на газоні Е. coli, що візуально нагадують лізис.

Попередній облік результатів можна проводити через (5-6) годин інкубації. На цьому етапі за наявності чітких зон лізису може бути видана попередня відповідь про наявність коліфагів у воді.

Остаточний кількісний облік прямого посіву проводиться через (18 ± 2) год. Результати виражають кількістю бляшкоутворюючих одиниць (БОЕ) на 100 мл проби води.

Якщо відмічено зливне зростання бляшок і рахунок скрутний, то за даними прямого посіву може бути виданий якісний результат: "виявлено в 100 мл води".

При отриманні негативного результату під час роботи прямим методом остаточна відповідь видається за результатами титрадіонного методу.

За наявності зон лізису у контрольній чашці результат дослідження вважається недійсним.

8.5.4. Постановка контролю

8.5.4.1. Негативний контроль

Негативний контроль підтверджує відсутність контамінації фагом поживних середовищ, лабораторного посуду, обладнання на етапах підготовки та проведення аналізу, а також дозволяє оцінити здатність тест-культури E . солі давати рівномірний газон.

Негативним контролем служить дослідження стерильної водопровідної води, яке проводиться аналогічно аналізованої пробі води. Так, під час аналізу води титраційним методом 10 мл стерильної водопровідної води вносять у додаткову пробірку. При аналізі води прямим посівом додаткову шосту чашку Петрі вносять 20 мл водопровідної стерильної води.

Додаткові посіви досліджуються на коліфаги аналогічно до основних проб.

При аналізі серії проб негативний контроль може бути один на кожен вид аналізу: титраційний та прямий. І тут постановка негативного контролю поетапно здійснюється після обробки всіх проб цієї серії.

У разі виявлення бляшок коліфагів у чашках із негативним контролем результати дослідження усієї серії проб води недійсні.

Слід перевірити стерильність лабораторного обладнання, посуду, живильного середовища, а також повторити контрольний посів на чистоту тест-штаму Е. coli K12 F+ StrR.

Кратність проведення негативного контролю – 1 раз на день.

8.5.4.2. Методика підтвердження фагової природи лізису

У сумнівних випадках під час роботи як титраційним, і прямими методами необхідно провести контрольний посів на підтвердження фагової природи лізису.

З цією метою бактеріологічною петлею вилучають ділянку агару, підозрілий на коліфаги, поміщають його в 5 мл поживного бульйону, куди додають краплю тест-культури Е. coli і інкубують при 37°С протягом (16-18) год. Отриману культуру обробляють хлороформом і досліджують наявність фага. Висів здійснюють петлею або піпеткою на сектори живильного агару аналогічно способу, описаному у п. 8.5.2.5. Ліза на будь-якому із секторів розцінюється як підтвердження наявності фага.

При цьому методі аналізу води певна кількість води пропускається через спеціальну мембрану з розміром пор близько 0.45 мкм. В результаті, на поверхні мембрани залишаються всі бактерії, що знаходяться у воді. Після чого мембрану з бактеріями поміщають на певний час у спеціальне живильне середовище при температурі 30-37 оС. Під час цього періоду, званого інкубаційним, бактерії отримують можливість розмножитися та утворити добре помітні колонії, які вже легко піддаються підрахунку. В результаті можна спостерігати таку: Або навіть таку картину:

Оскільки такий метод аналізу води передбачає лише визначення загальної кількості колонії — бактерій, що утворюють. різних типів, то за його результатами не можна однозначно судити про присутність у воді патогенних бактерій. Однак, висока мікробне числосвідчить про загальну бактеріологічну забрудненість води та про високу ймовірність наявності патогенних організмів.

При аналізі води треба контролювати не лише вміст токсичних хімічних речовин, а й кількість мікроорганізмів, що характеризують бактеріологічне забруднення питної води ОМЧ-загальне мікробне число.

Санітарно-мікробіологічне дослідження води проводиться в плановому
порядку з метою поточного нагляду, а також по спеціальних епідеміологічних
ким показанням. Основними об'єктами такого дослідження є:

- Питна вода центрального водопостачання (водопровідна вода);

- Питна вода нецентралізованого водопостачання;

- вода поверхневих та підземних вододжерел;

- стічні води;

- вода прибережних зон морів;

- Вода плавальних басейнів.

Основними показниками оцінки мікробіологічного стану питної води згідно з чинними нормативними документами є:

1. Загальне мікробне число (ЗМЧ) - кількість мезофільних бактерій в 1 мл воли.

Коли титр- Найменший об'єм води (в мл), в якому виявлено хоча б одну живу
мікробна клітина, що відноситься до БГКП.
Індекс БДКП- Кількість БГКП в 1 л води.

3. Кількість спор сульфітредукуючих клостридій у 20 мл води.

4. Число коліфагів у 100 мл води.

Визначення ЗМЧ дозволяє оцінити рівень мікробіологічного забруднення питної води. Цей показник незамінний для термінового виявлення масивного мікробного забруднення.

Загальне мікробне число- Це число мезофільних аеробних і факультативно анаеробних мікроорганізмів, здатних утворювати на живильному агарі при гемперазурі 37 ° С і протягом 24 годин колонії, видимі при дворазовому збільшенні.

При визначенні загального мікробного числа 1 мл досліджуваної води вносять у стерильну чашку Петрі та заливають 10-12 мл теплого (44 ° С) розплавленого живильного агару. Середовище акуратно перемішують з водою, рівномірно і
без бульбашок повітря розподіляючи дном чашки, після чого закривають кришкою і залишають до застигання. Посіви інкубують у термостаті при 37 °С протягом 24 годин. Підраховують загальну кількість колоній, які виросли в обох чашках, і визначають середнє значення. Остаточний результат виражають числом колонієутворюючих одиниць (КОЕ) в 1 мл досліджуваної води. В 1 мл питної води має бути не більше 50 ДЕЯ

Визначення БДКП
При цьому визначають загальні коліформні бактерії – ОКБ та термотолерантні коліформні бактерії – ТКБ.

ОКБ – грамамотрицатсльние, які не утворюють суперечку палички, що ферментують лактозу до кислоти і газу при температурі 37°С протягом 24 48 годин. ТКБ входять до числа ОКБ, обладжують їх ознаками, але ферментую при 44 ° С. Для визначення ентеробактерій - метод мебранних фільтрів або титраційний.

Мікробне число - основними критеріями оцінки мікробіологічного стану питної води,виходячи з діючих нормативних документів, є ЗМЧ (загальне мікробне число), яке характеризує кількість аеробних та анаеробних бактерій в одному мілілітрі води, що утворюються за добу при температурі 37 градусів, у живильному середовищі.

Якісні характеристики питної води систем водопостачання.

Цей показник є фактично незамінним швидкого виявлення масового мікробного забруднення.

Для визначення загального мікробного числаодин мл досліджуваної води вносять у стерильну чашку Петрі, потім заливають 10-15 мл теплого (близько 44 ° С) поживного агару в розплавленому вигляді. Середовище акуратно змішують з водою, рівномірно і без повітряних бульбашок повітря розподіляють по дну чашки, після цього закривають кришкою і залишають у чашці Петрі до застигання. Те саме роблять в іншій чашці. Посів у термостаті інкубують за температури 37 °С протягом доби. Потім при дворазовому збільшенні під мікроскопом підраховують загальну кількість колоній, що виросли у двох чашках, і визначають середнє значення. В 1 мл питної води не повинно бути більше 50 КУО.

(Основний метод)

Метод заснований на фільтрації певного об'єму води (300мл) через мембранні фільтри, вирощуванні посівів на диференційно-діагностичному середовищі з лактозою (Ендо) та подальшою ідентифікацією колоній за культуральними та біохімічними ознаками.

Мембранні фільтри підготовлені до аналізу (кип'ячені або стерилізовані іншим способом) поміщають стерильним пінцетом у вирву фільтрувального апарату. У вирву приладу наливають відмірений об'єм води і створюють вакуум. Після фільтрування фільтр знімають і, не перевертаючи, кладуть на поверхню живильного середовища Ендо.

На одну чашку можна помістити 3 фільтри. При дослідженні питної води фільтрують 3 об'єми 100 мл. при аналізі води невідомої якості доцільно фільтрувати інші обсяги води для отримання ізольованих колоній на фільтрі (10,40, 100 та 150 мл).

Чашки з фільтрами інкубують дном в термостаті при t 37оС протягом 24 годин.

Якщо на фільтрах немає зростання або виросли нетипові плівчасті, плісняві, розпливчасті колонії, видають негативний результат. ОКБ та ТКБ у 100 мл дослідженої води відсутні.

При зростанні на фільтрах типових ізольованих лактозопозитивних (темно-червоних з відбитками на звороті фільтра) колоній, підраховують їх кількість і починають підтвердження їх приналежності до ОКБ і ТКБ.

Проводять мікроскопію мазків з 3-4 колоній, пофарбованих за Грамом (враховують грамнегативні);

Визначають наявність оксидази (враховують оксидазонегативні, тому що оксидазопозитивні грамнегативні палички не відносяться до ентеробактерій, а можуть бути, наприклад, псевдомонадами);

Визначають ферментацію лактози до кислоти і газу при температурі 37оС, що важливо для слабозабарвлених колоній і відношення їх до ОКБ, і температурі 44± 0,5оС, щоб вирішити питання їх належності до ТКБ.

Постановка оксидазного тіста

На папір, змочений 1% спиртовим розчином -нафтола і 1% водним розчином диметилфенилендиамина, наносять платинової петлею або скляною паличкою частина пофарбованої колонії. реакцію вважають позитивною, якщо протягом 1 хвилини максимум 4-х з'являється синє або фіолетове забарвлення. Оксидазопозитивні колонії не враховують і подальшого дослідження не піддають.

Можна переносити фільтр із колоніями на папір змочений реактивом. Можна використовувати готові паперові системи (СІБ), змочені дистильованою водою.

На здатність ферментувати лактозу відчувають частини колоній грамнегативних оксидазонегативних бактерій. При цьому використовується напіврідке середовище з лактозою та індикатором рН. Посів проводиться уколом до дна 2 пробірки. Одна інкубується при температурі 37±1оС 24-48 годин на підтвердження ставлення до ОКБ, інша при температурі 44± 0,5оС 24 години, можливий облік через 4-6 годин, на підтвердження наявності ТКБ.

При накладенні колоній на фільтрі проводиться їх розсівання, потім отримані ізольовані колонії ідентифікуються. Колонії враховують як ОКБ – якщо вони червоні на Ендо, містять грамнегативні оксидазонегативні палички, що розкладають лактозу при температурі 37 оС до кислоти та газу. Колонії враховують як ТКБ, якщо вони містять грамнегативні оксидазонегативні палички, що ферментують лактозу при температурі 44 оС до кислоти та газу (схема № 2).

СХЕМА № 2

Дата публікації: 2014-11-02; Прочитано: 1811 | Порушення авторського права сторінки

studopedia.org - Студопедія. Орг - 2014-2018 рік. (0.001 с) ...

Загальне мікробне число

Так як такий метод аналізу води передбачає лише визначення загальної кількості колонії - утворюють бактерій різних типів, то за його результатами не можна однозначно судити про присутність у воді патогенних мікробів. Однак, високе мікробне число свідчить про загальну бактеріологічну забрудненість води та про високу ймовірність наявності патогенних організмів.

При аналізі води треба контролювати не тільки вміст токсичних хімічних речовин, а й кількість мікроорганізмів, що характеризують бактеріологічне забруднення питної води ОМЧ-загальне мікробне число. 100 ДЕЯ/мл

- Питна вода центрального водопостачання (водопровідна вода);

- Питна вода нецентралізованого водопостачання;

- вода поверхневих та підземних вододжерел;

- стічні води;

- вода прибережних зон морів;

- Вода плавальних басейнів.

1. Загальне мікробне число (ЗМЧ) - кількість мезофільних бактерій в 1 мл воли.

3. Кількість спор сульфітредукуючих клостридій у 20 мл води.

4. Число коліфагів у 100 мл води.

Мікробне число - основними критеріями оцінки мікробіологічного стану питної води,виходячи з чинних нормативних документів, є ЗМЧ (загальне мікробне число), яке характеризує кількість аеробних та анаеробних бактерій в одному мілілітрі води, що утворюються за добу при температурі 37 градусів, у живильному середовищі. Цей показник є фактично незамінним швидкого виявлення масового мікробного забруднення.

Принципи нормування питної води

Те саме роблять в іншій чашці. Посів у термостаті інкубують за температури 37 °С протягом доби. Потім при дворазовому збільшенні під мікроскопом підраховують загальну кількість колоній, що виросли у двох чашках, і визначають середнє значення. В 1 мл питної води не повинно бути більше 50 КУО.

За період з 9 січня до 10 жовтня 2014р. до відділу ветеринарно-санітарної експертизи ФДБУ «Тульська МВЛ» надійшло – 302 проби води, проведено – 693 дослідження, з них, на показники ОКБ, ТКБ-458 досліджень.

Що це за показники і чому саме їм приділяється увага при оцінці питної води?

Вода – основна складова частинабудь-якого організму, грає величезну роль його життєдіяльності. Вона є довкіллям різних мікроорганізмів, серед яких є і патогенні. Виявлення патогенів – найточніший показник забруднення води. До таких мікроорганізмів відносяться бактерії групи кишкової палички – БГКП (бактерії групи кишкової палички), також називаються коліморфними та коліформними бактеріями) - умовно виділяється за морфологічними та культуральними ознаками група бактерій сімейства ентеробактерій, що використовується санітарною мікробіологією як маркер фекальної контамінації. Серед коліформних бактерій часто визначається наявність у питній воді загальних та термотолерантних коліформних бактерій (ОКБ, ТКБ), що свідчить про неякісне водопостачання та можливе фекальне забруднення вододжерела, що створює потенційну загрозу розвитку та поширенню кишкових захворювань.

У системах водопостачання з підготовленою водою коліформні бактерії не повинні виявлятися (СанПіН). Присутність коліформних організмів говорить про недостатню очистку води, про її вторинне забруднення, про наявність у воді поживних речовин. Допускається випадкове попадання коліформних організмів у систему, але не більше 5% проб, відібраних протягом року. При виявленні у пробі питної води ТКБ, ОКБ) негайно здійснюють їх визначення повторних пробах.

ТКБ (термотолерантні коліформні бактерії). Це група коліформних організмів, здатних ферментувати лактозу за 44-45°С. Вони швидко виявляються, тому служать з метою оцінки ефективності очищення води від фекальних бактерій.

ОКБ (Загальні Коліформні Бактерії) – Група ОКБ включає достатньо велике числопологів сімейства Enterobacteriacea, представники яких здатні зброджувати лактозу: Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Rahnella та ін. Серед цих мікроорганізмів також є велика кількість вільноживучих сапрофітів, тому показник ОКБ є важливим технологічним (індикаторним).

Відповідно, якщо ці бактерії перебувають у питній воді, це означає, що є можливість забруднення води стічними водами.

Результати визначення показників ОКБ, ТКБ подаються у вигляді КУО/100 мл; коліформні бактерії не повинні виявлятися в 100 мл питної води при триразовому дослідженні об'єму, що нормується.

Як би там не було, будь-який підвищений вміст бактерій у воді – це тривожна ознака, і за його появи потрібно щось робити з водою.

Для проведення мікробіологічних досліджень питної води можна звернутися до ФДБУ «Тульська МВЛ».

Вода є природним середовищем проживання різноманітних. різні видибактерій, гриби, найпростіші та водорості). Сукупність усіх водних організмів називається мікробіальний планктон. На кількісний склад мікрофлори основний вплив надає походження води - прісні поверхневі (проточні води річок, струмків; стоячі озер, ставків, водосховищ), підземні (грунтові, грунтові, артезіанські), атмосферні та солоні води. За характером користування виділяють питну воду (централізованого та місцевого водопостачання), воду плавальних басейнів, лід медичний та господарську. Особливої уваги вимагають стічні води.

Мікрофлору водойм утворюють дві групи:

Автохтонні (або водні) та

Аллохтонні (що потрапляють ззовні при забрудненні із різних джерел) мікроорганізми.

1. Автохтонна мікрофлора – сукупність мікроорганізмів, які постійно живуть і розмножуються у воді. Як правило, мікрофлора води нагадує мікробний склад ґрунту, з яким вода стикається. До її складу входять мікрококи, сарцини, деякі види Proteusі Leptospira.З анаеробів – Bacillus cereusта деякі види клостридій. Ці мікроорганізми грають значну рольу кругообігу речовин, розщеплюючи органічні відходи, клітковину та ін.

2. Біологічне забруднення водойм.

Зі стічними, зливовими, талими водами у водойми потрапляють багато видів мікроорганізмів, що різко змінюють мікробний біоценоз. Основний шлях мікробного забруднення – потрапляння неочищених міських відходів та стічних вод. Також – при купанні людей, худоби, пранні білизни та ін. У воду можуть потрапляти представники нормальної мікрофлори людини, УП, патогенної (збудники кишкових інфекцій, лептоспірозів, єрсиніозів, віруси поліомієліту, гепатиту А тощо). Слід пам'ятати, що вода не є сприятливим середовищем для розмноження патогенних мікроорганізмів, для яких біотоп є організм людини або тварин.

Самоочищення водойм

Звільнення від контамінуючих мікроорганізмів спостерігається після органічного забруднення водойм за рахунок конкурентної активації сапрофітної мікрофлори, що призводить до швидкого розкладання органічних речовин, зменшення чисельності бактерій, особливо «фекальних». Існує термін «сапробність» - (sapros – гнилий, грец.) позначає комплекс особливостей водойми, у тому числі склад та кількість мікроорганізмів у воді, що містить органічні та неорганічні речовиниу певних концентраціях. Процеси самоочищення води у водоймах відбуваються послідовно та безперервно. Розрізняють полісапробні, мезасапробні та олігосапробні зони.

Полісапробні зони- Зони сильного забруднення. Містять велику кількість органічних речовин і майже позбавлені кисню. Кількість бактерій в 1 мл води у полісапробній зоні досягає мільйона і більше.

Мезасапробні зони- Зони помірного забруднення. Кількість мікроорганізмів – сотні тисяч на 1 мл.

Олігосапробні зони- Зони чистої води. Характеризуються процесом самоочищення, що закінчився. Кількість бактерій від 10 до 1000-1 мл води.

Таким чином, патогенні мікроорганізми, що потрапляють у водойму, досить рясні в полісапробних зонах, поступово відмирають у мезосапробних і практично не виявляються в олігосапробних зонах.

При санітарно-мікробіологічному дослідженні води виділяють ОКБ, ентерококи, стафілококи та патогенні мікроорганізми (сальмонели, холерні вібріони, лептоспіри, шигели та ін.). Усі санітарно-мікробіологічні дослідження води регламентують відповідні ГОСТ.

Підстави для санітарно-мікробіологічного дослідження води:

Вибір джерела централізованого водопостачання та контроль за ним;
контроль ефективності знезараження питної води централізованого водопостачання;
Спостереження за підземними джерелами водопостачання (артезіанські свердловини, ґрунтові води тощо);
Спостереження за джерелами індивідуального водокористування (колодязі, джерела та ін.);
Спостереження за санітарно-епідеміологічним станом води відкритих водойм;
контроль ефективності знезараження води плавальних басейнів;
Перевірка якості очищення та знезараження стічних вод;
Розслідування водяних спалахів інфекційних хвороб.

Санітарно-мікробіологічний аналіз питної води

В даний час регламентується Методичними вказівкамиМЗК 4.2.1018-01.

1. Визначення ЗМЧ– загальна кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів, здатних утворювати колонії на живильному агарі при t 0 37 0C протягом 24 годин.

З кожної проби роблять посів не менше двох об'ємів по 1 мл у 2 чашки. години. Потім підраховують всі виросли на чашці колонії зі збільшенням у 2 разу (але не більше 300 колоній на чашці). Кількість колоній на чашках підсумовують і ділять на 2 – результат виражають у КУО на 1 мл води. Допускається до 50 КУО на 1 мл води.

Визначення загальних та термотолерантних коліформних бактерійметодом мембранної фільтрації (основний метод).

Загальні коліформні бактерії.грам-, оксидаза-, що не утворюють суперечку палички, здатні рости на диференціальних лактозних середовищах, що ферментують лактозу до КГ при t 0 37 0 С протягом 24 годин.

Термотолерантні коліформні бактерії.входять до числа ОКБ, мають всі їхні ознаки, крім того, здатні ферментувати лактозу до КГ при t 0 44 0 С протягом 24 годин.

Аналізують 3 обсяги по 100 мл, можна дробити обсяги (10, 40, 100, 150 мл). Відміряний обсяг води фільтрують через мембранні фільтри. Фільтри поміщають на середовище Ендо (до трьох фільтрів на 1 чашку) і інкубують t 0 37 0 протягом 24 годин.

Якщо немає зростання – негативний результат – ОКБ та ТКБ не виявлено. Якщо є типові лактозопозитивні колонії з відбитком на звороті фільтра, підраховують, підтверджують їхню приналежність до ОКБ та ТКБ. Для цього досліджується

Оксидазна активність

Приналежність до грамнегативних бактерій

Ферментація лактози до КГ (у двох пробірках – при t 0 37 0 С та 44 0 С).

Результат вираховують за формулою Х=а∙100/V, де

а – число колоній (у сумі),

V – обсяг води (у сумі),

Х – число колоній 100 мл води.

Результат виражають у КУО ОКБ (ТКБ) в 100 мл води. У нормі ОКБ (ТКБ) 100 мл води питної не повинні визначатися.

Також визначають

Суперечки сульфітредукуючих клостридій– спороутворюючі анаеробні паличкоподібні бактерії, що редукують сульфіт натрію на залізо-сульфітному агарі при t 0 44 0 С протягом 16-18 годин. Метод заснований на вирощуванні посівів у залізо-сульфітному агарі в умовах, наближених до анаеробних, та підрахунку числа чорних колоній.

Об'єм води 20 мл прогрівають на водяній бані 75-80 0 С протягом 15 хвилин для виключення вегетативних форм, потім фільтрують через бактеріальний фільтр, який поміщають в пробірку з розплавленим залізо-сульфітним агаром (70-80 0 С), остуджують, поміщають термостат t 0440 С на 16-18 годин.

Визначення коліфагів.

Коліфаги – віруси бактерій, здатні лізувати E.coliта формувати при t 0 37 0 С через 18-20 годин зони лізису бактеріального газону (бляшки) на живильному агарі. Число бляшок не підраховується - якісний аналіз.

Дослідження стічних водрегламентується МУ 2.1.5.800 – 99 «Організація Держсанепіднагляду за знезараженням стічних вод», 1999 рік. Застосовують прямий посів на 4 чашки із середовищем Ендо по 0,5 мл (2 мл – весь об'єм). Потім підраховують кількість КУО ОКБ і ТКБ, роблять перерахунок на 100 мл води.

Вода басейнівдосліджується за Санітарно-епідеміологічними правилами та нормативами - СанПіН 2.1.2.1188-03. У 100 мл води басейнівдопускається не більше 1 ДЕЯ ОКБ, не допускається ТКБ, коліфаги, золотистий стафілокок, збудники кишкових інфекцій, синьогнійна паличка. Лабораторний контроль за основними мікробіологічними показниками (ОКБ, ТКБ, коліфаги та золотистий стафілокок) проводиться 2 рази на місяць. Дослідження на наявність збудників кишкових інфекцій проводяться за несприятливої епідемічної ситуації.

При появі спорадичних випадків пневмоній неясної етіології або виникнення серед відвідувачів басейну епідемічних позасезонних спалахів ГРЗ проводяться дослідження води на наявність легіонел ( Legionella pneumophilia), розмноженню яких сприяє тепла водата бризки. При диханні дрібнодисперсний аерозоль, що містить легіонели, потрапляє в легені, що може спричинити хворобу легіонерів або понтіакську лихоманку.

Додаток №2

До СанПіН 2.1.2.1188-03

ЗАХВОРЮВАННЯ ІНФЕКЦІЙНОЇ ПРИРОДИ,

ЯКІ МОЖУТЬ ПЕРЕДАВАТИСЯ ЧЕРЕЗ ВОДУ ПЛАВАЛЬНИХ БАСЕЙНІВ

Захворювання	Ступінь зв'язку з водним фактором
1. Адено-вірусна фаринго-кон'юктивальна лихоманка	+++
2.Епідермофітія («короста плавців»)	+++
3.Вірусний гепатит А	++
4.Коксакі-інфекція	++
5.Дизентерія	++
6. Отити, синусити, тонзиліти, кон'юктивіти	++
7.Туберкульоз шкіри	++
8. Грибкові захворювання шкіри	++
9.Легіонельоз	++
10. Ентеробіоз	++
11. Лямбліоз	++
12.Криптоспорідіоз	++
13.Поліомієліт	+
14.Трахома	+
15. Гоноррейний вульвовагініт	+
16. Гострі сальмонельозні гастроентерити	+
Зв'язок з водним фактором: +++ - висока, ++ - суттєва, + - можлива

Коментарі до таблиці.Оцінюючи кількість ОКБ і ТКБ у 100 см 3 води, слід аналізувати щонайменше три обсяги води (по 100 см 3 кожен). При оцінці ОКБ та ЗМЧ перевищення нормативу не допускається у 95% проб, що відбираються протягом року. Коліфаги визначають тільки в системах водопостачання з поверхневих джерел перед подачею води в розподільчу мережу, те саме стосується наявності цист лямблій. Зміст спор сульфітредукуючих клостридій визначають лише в оцінці ефективності технології обробки води. У разі виявлення ТКБ, ОКБ, коліфагів або хоча б одного із зазначених показників знову проводять повторне екстрене дослідження води на ТКБ, ОКБ та коліфаги. Паралельно проводять дослідження води на хлориди, амонійний азот, нітрати та нітрити. Якщо і в повторно взятій пробі виявляються ОКБ більше двох у 100 см 3 та/або ТКБ, та/або коліфаги, проводять дослідження на патогенні бактерії кишкової групи та/або ентеровіруси. Таке ж дослідження на патогенні ентеробактерії та ентеровіруси проводять за епідеміологічними показаннями за рішенням територіальних центрів Росспоживнагляду.

Термотолерантні коліформні бактерії (ТКЛ)входять до складу ОКБ і мають всі їхні ознаки, але, на відміну від них, здатні ферментувати лактозу до кислоти, альдегіду і газу при температурі +44 °С протягом 24 год. Таким чином, ТКБ відрізняються від ОКБ здатністю ферментувати лактозу до кислоти і газу при вищій температурі.

Визначені показники, кількість і періодичність досліджень залежить від типу джерела водопостачання, чисельності населення, що забезпечується водою з системи водопостачання. Ці дані наведені в СанПіН 2.1.4.1074–01. У методичних вказівках щодо санітарно-мікробіологічного аналізу питної води ( МУК 4.2.1018-01 Міністерства охорони здоров'я РФ) регламентовано методи санітарно-мікробіологічного контролю якості питної води.

Загальна кількість мікроорганізмів- це загальна кількість видимих при дворазовому збільшенні мезофільних (мають температурний оптимум +37 °С) аеробних і факультативно анаеробних мікроорганізмів (МАФАнМ), які здатні утворювати колонії на живильному агарі при температурі +37 °С протягом 24 год. стерильну чашку Петрі вносять 1 мл води і заливають розплавленим (температура не вище +50 ° С) м'ясопептонним агаром, а через добу підраховують кількість колоній, що виросли.

ВИЗНАЧЕННЯ ОКБ І ТКБ МЕТОДОМ МЕМБРАННИХ ФІЛЬТРІВ

Метод ґрунтується на фільтруванні певних обсягів води через мембранні фільтри. Для цих цілей використовують фільтри з діаметром пор 0,45 мкм та розміром 35 або 47 мм у діаметрі (вітчизняні фільтри «Владипор» МФАС–С–1, МФАС–С–2, МФАС–МА (№ 4–6) або закордонні - ISO 9000 чи EN 29000). Мембранні фільтри готують до аналізу відповідно до інструкцій заводу - виробника.

ВИЗНАЧЕННЯ ОКБ І ТКБ ТИТРАЦІЙНИМ МЕТОДОМ

Метод заснований на накопиченні бактерій після посіву певних об'ємів води в рідкі живильні середовища, з наступним пересіванням на диференціальне щільне середовище з лактозою та ідентифікації колоній з культуральних та біохімічних тестів. При дослідженні питної води якісним методом (поточний санепіднагляд) засівають три об'єми по 100 см 3 . При дослідженні води з метою кількісного визначення ОКБ та ТКБ (повторний аналіз) засівають відповідно 100, 10 та 1 см 3 - по три обсяги кожної серії.

САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ҐРУНТУ

Ґрунт дає притулок різноманітним мікроорганізмам. Так, кількість тільки бактерій у ґрунті досягає 10 млрд. клітин в 1 р. Мікроорганізми беруть участь у ґрунтоутворенні та самоочищенні ґрунту, у кругообігу в природі азоту, вуглецю та інших елементів. У ній крім бактерій мешкають гриби, найпростіші і лишайники, що є симбіозом грибів з ціанобактеріями. На поверхні ґрунту мікроорганізмів відносно мало через згубну дію УФ-променів, висушування та інших факторів. Орний шар ґрунту товщиною 10-15 см містить найбільшу кількість мікроорганізмів. У міру поглиблення кількість мікроорганізмів зменшується аж до їх зникнення на глибині 3–4 м. Склад мікрофлори ґрунту залежить від його типу та стану, складу рослинності, температури, вологості тощо. Більшість ґрунтових мікроорганізмів здатні розвиватися при нейтральному рН, високій відносній вологості, температурі від 25 до 45 °С.

У ґрунті живуть спороутворюючі палички пологів Bacillusі Closlridium.Непатогенні бацили (Вас. megaterium, Вас. subtilisта ін.). поряд з псевдомонадами, протеєм та деякими іншими бактеріями є аммоніфікуючими, складаючи групу гнильних бактерій, що здійснюють мінералізацію органічних речовин. Патогенні спороутворюючі палички (збудники сибірки, ботулізму, правця, газової гангрени) здатні довго зберігатися, а деякі навіть розмножуватися в грунті ( Clostridiumbotulinum). Ґрунт є також місцем проживання азотфіксуючих бактерій, що засвоюють молекулярний азот (Azotobacter, Azomonas, Mycobacteriumта ін.). Азотфіксуючі різновиди ціанобактерій, або синьо-зелених водоростей застосовують для підвищення родючості рисових полів.

Представники сімейства кишкових бактерій (сім. Enterobacteriaceae) -кишкова паличка, збудники черевного тифу, сальмонельозів та дизентерії, потрапивши у ґрунт із фекаліями, відмирають. У чистих ґрунтах кишкова паличка та протей зустрічаються рідко; Виявлення бактерій групи кишкової палички (коліформних бактерій) у значних кількостях є показником забруднення ґрунту фекаліями людини та тварин і свідчить про її санітарно-епідеміологічне неблагополуччя через можливість передачі збудників кишкових інфекцій. Кількість найпростіших у ґрунті коливається від 500 до 500 000 на 1 г ґрунту. Харчуючи бактеріями та органічними залишками, найпростіші викликають зміни у складі органічних речовин ґрунту. У ґрунті знаходяться також численні гриби, токсини яких, накопичуючись у продуктах харчування людини, викликають інтоксикації – мікотоксикози та афлатоксикози.

Результати дослідження ґрунтів враховують при визначенні та прогнозі ступеня їх небезпеки для здоров'я та умов проживання населення в населених пунктах (за епідеміологічними показаннями), профілактиці інфекційної та неінфекційної захворюваності (попереджувальний санітарний нагляд), поточному санітарному контролі за об'єктами, що прямо чи опосередковано впливають .

При проведенні поточного санітарного нагляду за станом ґрунту обмежуються коротким санітарно-мікробіологічним аналізом, що вказує на наявність та ступінь фекального забруднення. Показники, включені до цієї групи, також характеризують процеси самоочищення ґрунту від забруднювачів органічної природи та ентеробактерій. Повний санітарно-мікробіологічний аналіз ґрунту проводять у формі запобіжного санітарного нагляду. Вплив хімічних полютантів на біогеоценоз передбачає дослідження їх бактерицидної дії на ґрунтову мікробіоту, як наслідок: зміна спільноти ґрунтових мікроорганізмів, ферментативної активності ґрунту. За епідемічними показаннями проводять індикацію патогенної мікробіоти.

У лабораторії з 5 точкових проб ґрунту, взятих з однієї ділянки, готують усереднену пробу, ретельно перемішуючи і розтираючи в стерильній фарфоровій чашці гумовим товкачем протягом 5 хв. Сторонні домішки (коріння рослин, каміння, тріски) видаляють шляхом просіювання ґрунту через сито, яке попередньо протирають ватним тампоном, змоченим 96% етиловим спиртом. З усередненої проби відбирають навішування (від 1 до 50-55 г залежно від переліку показників) і готують суспензію 1:10 на стерильній водопровідній воді (10 г грунту на 90 см 3 води). Для десорбції мікроорганізмів з поверхні ґрунтових частинок підготовлену ґрунтову суспензію струшують протягом 3 хв на мішалці механічного диспергатора. Після відстоювання суспензії протягом 30 с, готують послідовні 10-кратні розведення ґрунту до концентрації 10 -4 -10 -5 г/см 3 .

Оцінку результатів санітарно-мікробіологічного дослідження ґрунтів проводять шляхом зіставлення даних, отриманих на дослідних та контрольних ділянках ґрунтів однакового складу, розташованих у безпосередній територіальній близькості. Схеми оцінки санітарного стану ґрунту на підставі окремих санітарно-мікробіологічних критеріїв представлені в МУ № 14446-76(Табл. 2).

Таблиця 2. Схема оцінки санітарного стану ґрунту за мікробіологічними показниками (за МУ № 1446-76)

	Титр (г)			Індекс термофільних мікроорганізмів (кількість клітин/г)
	БДКП	Нітрифікуючих бактерій	Клостридій
			0,01 і вище
Забруднена
Сильно забруднена	0,009 і нижче	0,0009 і нижче	0,00009 і нижче

У МУ 2.1.7.730–99 «Гігієнічна оцінка якості ґрунту населених місць»представлено схему оцінки епідемічної небезпеки ґрунтів населених місць. У цьому документі для оцінки інтенсивності біологічного навантаження на ґрунт використовуються такі показники як БГКП та індекс ентерококів, а для оцінки епідемічної небезпеки ґрунту – патогенні ентеробактерії та ентеровіруси.

ДОСЛІДЖЕННЯ МІКРОБНОГО ОБСЄМЕННОСТІ ПОВІТРЯНОГО СЕРЕДОВИЩА

У повітря потрапляють мікроорганізми з ґрунту, води і з поверхні тіла, з дихальних шляхів і з краплями слини людини і тварин. Тут виявляються кокоподібні та паличкоподібні бактерії, бацили, клостридії, актиноміцети, гриби та віруси. Повітря розглядають як фактор передачі респіраторних інфекцій, при яких збудник передається повітряно-краплинним або повітряно-пиловим шляхом. Сонячні промені та інші фактори сприяють загибелі мікрофлори повітря. Для зниження мікробної обсіменіння повітря проводять вологе прибирання приміщення в поєднанні з вентиляцією та очищенням (фільтрацією) повітря, що надходить. Застосовують також аерозольну дезінфекцію та обробку приміщень лампами ультрафіолетового випромінювання (наприклад, у мікробіологічних лабораторіях та операційних блоках).

Багато мікроорганізмів міститься в повітрі закритих приміщень, мікробна обсімененість яких залежить від умов прибирання приміщення, рівня освітленості, кількості людей у приміщенні, частоти провітрювання та ін. Особливо мало мікроорганізмів у повітрі над лісами, горами та морями.

Мікробіологічне дослідження повітря передбачає визначення загального вмісту мікроорганізмів, а також стафілококів в 1 м3 повітря. В окремих випадках проводять дослідження повітря на грамнегативні бактерії, плісняві та дріжджоподібні гриби. За епідемічними показаннями спектр збудників, що виявляються в повітрі, може бути розширений.

Проби повітря відбирають методом аспірації з використанням апарату Кротова.

Цілком допускається використання седиментаційного методу Коха. Дослідженню підлягають наступні приміщення ЛПЗ – операційні блоки, перев'язувальні та процедурні кабінети, асептичні палати (бокси), палати відділення анестезіології та реанімації, палати та коридори лікувальних відділень, приміщення аптек, стерилізаційних та акушерсько-гінекологічних відділень та станцій.

Дослідження повітря методом Коха використовують у рідкісних випадках для орієнтовної оцінки ступеня мікробного забруднення повітря. Для визначення загальної кількості мікроорганізмів у повітрі операційних до початку роботи відкривають чашки з живильним агаром і встановлюють їх приблизно на висоті операційного столу – одну чашку в центрі та чотири в кутах приміщення («метод конверта») на 10 хв, а для виявлення золотистого стафілокока ( використовуються чашки з жовтково - сольовим агаром (ЖСА) - на 40 хв. 2 поверхні живильного середовища за 5 хв експозиції осідає така кількість бактерій, що міститься в 10 л повітря (в 1 м 3 міститься 1000 літрів). має виявлятися.

САНІТАРНО-МІКРОБІОЛОГІЧНИЙ КОНТРОЛЬ ОБ'ЄКТІВ ПРОДОВОЛЬЧОГО ПРИЗНАЧЕННЯ

Харчові продукти можуть обсіменятися різними мікроорганізмами, що призводить до їх псування, розвитку харчових токсикоінфекцій та інтоксикацій, а також таких інфекцій як сибірка, бруцельоз, туберкульоз та ін. Захворювання тварини, травми або несприятливі умови її утримання сприяє порушенню захисних бар'єрів організму та транслокації (перенесення) мікроорганізмів у звичайно стерильні тканини та органи (прижиттєве обсіменіння). В результаті відбувається обсіменіння тканин забитої тварини протями, клостридіями та іншими мікробами; потрапляння при маститах у молоко стафілококів та стрептококів. Можливе і вторинне обсіменіння мікроорганізмами харчових продуктів. У цьому випадку джерелом забруднення є об'єкти навколишнього середовища (ґрунт, вода, транспорт тощо), а також хворі люди та бактеріоносії. При низькій температурі зберігання м'яса та м'ясних продуктів навіть у замороженому м'ясі можуть переважати мікроби, здатні до розмноження у психрофільних умовах (псевдомонади, протей, аспергіли, пеніцили та ін.). Мікроби, що мешкають у м'ясі, викликають його ослизнення; у ньому розвиваються процеси бродіння та гниття, викликані клостридіями, протеєм, псевдомонадами та грибами.

Злакові культури, горіхи в умовах підвищеної вологості можуть забруднюватись грибами (аспергілами, пеніциллами, фузаріум та ін), що спричиняє розвиток харчових мікотоксикозів.

М'ясні страви (студні, салати з м'яса, страви з м'ясного фаршу) можуть з'явитися причиною захворювань, пов'язаних з сальмонелами, шигелами, діареєгенними кишковими паличками, протеєм, ентеротоксигенними штамами стафілококів, ентерококами, Closlridium perfringensі Bacillus cereus.

Молоко та молочні продукти можуть бути фактором передачі збудників бруцельозу, туберкульозу та шигельозу. Можливий також розвиток харчових отруєнь внаслідок розмноження у молочних продуктах сальмонел, шигел та стафілококів. Яйця, яєчний порошок та меланж при ендогенному первинному інфікуванні сальмонелами яєць, особливо качиних, є причиною сальмонельозу.

Риба та рибні продукти частіше забруднюються бактеріями Closlridium botulinumі Vibrio parahaemolylicus- збудниками харчових інтоксикацій та токсикоінфекцій. Ці захворювання спостерігаються і при вживанні рибних продуктів, забруднених великою кількістю сальмонел, протею, Bacillus cereus, Closlridium perfringens.

Овочі та фрукти можуть забруднюватися та обсіменяються діареєгенними кишковими паличками, шигелами, протеєм, ентеропатогенними штамами стафілококів. Солоні огірки можуть бути причиною токсикоінфекції, спричиненої Vibrio parahаemolyticus.

Усі результати мікробіологічного аналізу харчових продуктів можна отримати не раніше 48–72 год, тобто. коли продукт може бути реалізований. Тому контроль за цими показниками має ретроспективний характер і служить цілям санітарно - гігієнічної оцінки підприємства, що виробляє або реалізує харчові продукти.

Виявлення підвищеної загальної мікробної обсіменіння, коліформних бактерій дозволяє припустити порушення температурного режиму при приготуванні та/або зберіганні готового продукту. Виявлення патогенних мікроорганізмів розцінюють як показник епідеміологічного неблагополуччя їдальні, підприємства торгівлі.

Нормування мікробіологічних показників безпеки харчових продуктів здійснюється більшість груп мікроорганізмів за альтернативним принципом, тобто. нормується маса продукту, де не допускаються бактерії групи кишкових паличок, більшість умовно - патогенних мікроорганізмів, і навіть патогенні мікроорганізми, зокрема. сальмонели та Listeria monocytogenes. В інших випадках норматив відображає кількість колонієутворюючих одиниць в 1 г (см 3) продукту (КОЕ/г, см 3).

У продуктах масового споживання, для яких у таблицях СанПіН 2.3.2.1078-01. Гігієнічні вимоги до безпеки та харчової цінності харчових продуктіввідсутні мікробіологічні нормативи, патогенні мікроорганізми, зокрема. сальмонели, що не допускаються в 25 г продукту.

Санітарно-бактеріологічному контролю обов'язково повинні піддаватися об'єкти приготування та реалізації харчової продукції

Дані санітарно-мікробіологічного дослідження дають змогу об'єктивно оцінити санітарно-гігієнічний стан обстежуваних об'єктів, виявити порушення санітарного режиму та оперативно проводити цілеспрямовані заходи щодо їх усунення.

Розрізняють кілька способів відбору проб з різного обладнання та інвентарю для мікробіологічного дослідження: способи тампонних змивів, відбитків, агарової заливки. З них найчастіше використовують спосіб тампонних змивів.

Санітарно-мікробіологічний контроль заснований на виявленні у змивах бактерій групи кишкових паличок (БГКП) – показників фекального забруднення досліджуваних предметів. Дослідження на стафілокок, патогенні бактерії сімейства кишкових, визначення загальної мікробної обсіменіння проводять за показаннями. Наприклад, взяття змивів для виявлення стафілококів необхідне при обстеженнях кондитерських цехів, молочних кухонь та харчоблоків лікувальних закладів.

Об'єкти санітарно-мікробіологічного контролю:

∨ змиви з рук та спецодягу працівників харчування (водопостачання);

∨ обладнання, інвентар, посуд та інші об'єкти;

∨ готові страви, кулінарні та швидкопсувні вироби;

∨ сировину та напівфабрикати в процесі технологічного процесу (за епідпоказаннями);

∨ питна вода централізованого та особливо децентралізованих джерел водопостачання.

Змив з рук персоналу, зайнятого обробкою сирих продуктів, забирають на початок роботи. Змив доставляють до бактеріологічної лабораторії протягом 2 годин. Допускається їх зберігання та транспортування не більше 6 годин при температурі +1–10 °С.

У лабораторії виробляють посіви змивів на середовищі Кесслер з лактозою або КОДА, при цьому в пробірку з середовищем опускають тампон і переносять змивну рідину, що залишилася. Посіви на середовищах Кесслер та КОДА інкубують за 37 °С.

Через 18-24 год. з усіх пробірок з середовищем Кесслер виробляють висів на сектори чашок з середовищем Ендо, з середовища КОДА висів роблять тільки у разі зміни забарвлення середовища (з вихідного фіолетового до жовтого або зеленого) або його помутніння. Посіви на середовищі Ендо вирощують за 37 °С 18–24 год.

З колоній, характерних для БГКП, готують мазки, забарвлюють за Грамом, мікроскопують, при необхідності додатково ідентифікують за загальноприйнятими тестами для бактерій групи кишкових паличок. При оцінці результатів санітарно-мікробіологічного обстеження виходять із нормативів, що у змивах, взятих з об'єктів продовольчого призначення, БГКП мають бути відсутніми. Виявлення БГКП у змивах з чистих поверхонь, підготовлених до роботи предметів, інвентарю, обладнання, рук та санітарного одягу персоналу свідчить про порушення санітарного режиму. У разі повторного виявлення БГКП у значному відсотку змивів рекомендується провести дослідження змивів на наявність патогенних ентеробактерій. При цьому виробляють посів тампона та змивної рідини на середовищі збагачення - селенітовий бульйон або магнієве середовище (можливе використання середовищ Мюллера та Кауфмана). Подальше дослідження проводять за загальноприйнятою методикою.

ДОСЛІДЖЕННЯ МОЛОКУ ТА МОЛОЧНИХ ПРОДУКТІВ

МІКРОФЛОРА МОЛОЧНИХ ПРОДУКТІВ

Молоко є дуже сприятливим живильним середовищем у розвиток багатьох мікроорганізмів. Після вживання в їжу інфікованого молока та молочних продуктів можуть виникати такі інфекції, як черевний тиф, дизентерія, холера, ешеріхіози, бруцельоз, туберкульоз, скарлатина, ангіна, Ку - лихоманка, ящур, кліщовий енцефаліт, сальмонелінфекція.

Розрізняють специфічну та неспецифічну мікрофлору молока та молочних продуктів.

До специфічної мікрофлори молока та молочних продуктів відносять мікробів - збудників молочнокислого, спиртового та пропіоновокислого бродіння. Мікробіологічні процеси за рахунок життєдіяльності цих мікроорганізмів лежать в основі приготування кисломолочних продуктів (сиру, кефіру, кислого молока, ацидофіліну та ін.).

Бактерії молочнокислого бродіння вважаються нормальною мікрофлорою молока та молочних продуктів . Головну роль при скисанні молока та молочних продуктів відіграють молочнокислі стрептококи. S. lactis, S. cremarisта ін. Менш активні раси молочнокислих стрептококів ( S. citrovorus, S. lactis subsp. diacetylactis) продукують леткі кислоти та ароматичні речовини і тому широко використовуються при отриманні сирів. До групи молочнокислих бактерій також входять молочнокислі палички: Lactobacterium bulgaricum, Lactobacterium casei, Lactobacterium acidophilusі т.д.

Основними збудниками спиртового бродіння в молоці та молочних продуктах є дріжджі ( Saccharomyces lactisта ін.).

Неспецифічну мікрофлору молока складають гнильні бактерії ( Proteus), аеробні та анаеробні бацили ( В. subtilis, В. megatherium, C. putrificum) і багато інших

Мікробне обсіменіння молока починається вже у вимені. У процесі доїння відбувається додаткове його обсіменіння з поверхні шкіри вимені, з рук, з судини, куди воно надходить і повітря приміщення. Інтенсивність цього додаткового обсіменіння загалом залежить від цього, наскільки дотримуються елементарні санітарно - гігієнічні умови при отриманні молока. Погані умови зберігання молока також можуть сприяти подальшому наростанню в ньому мікрофлори.

Бактерицидна фаза. Свіжовидоїне молоко, хоч і містить уже сотні мікробів в 1 см 3 (головним чином, стафілококи і стрептококи), має бактерицидні властивості за рахунок присутності в ньому нормальних антитіл. Тому протягом деякого періоду розвиток бактерій у молоці затримується. Цей період називають бактерицидною фазою. Тривалість бактерицидної фази коливається в межах 2-36 годин залежно від фізіологічних особливостей тварини (у ранньому періоді лактації бактерицидність молока вища).

Зберігання молока при підвищеній температурі (30-37 ° С) різко скорочує тривалість бактерицидної фази. Такий вплив впливає і інтенсивне додаткове обсіменіння молока мікробами.

Після того, як бактерицидна фаза закінчилася, настає розвиток мікрофлори. Видовий склад її змінюється в часі під впливом змін біохімічних властивостей середовища та внаслідок антагоністичних та симбіотичних взаємин між мікробними видами.

Фаза змішаної мікрофлори. Вона триває близько 12 год. У цей період ще не настає переважання будь-яких видових груп мікробів, оскільки велика кількість поживного субстрату і просторові можливості дозволяють досить вільно розвиватися багатьом видам мікроорганізмів.

Фаза молочнокислих стрептококів. У цій фазі одержують переважання мікроорганізми названої групи ( S. lactis, S. termofilus, S. cremorisта ін.). Лактоза посилено перетворюється ними на молочну кислоту, реакція змінюється на кислу сторону. Накопичення молочної кислоти веде, надалі до відмирання молочнокислих стрептококів та зміні їх більш кислотостійкими молочнокислими бактеріями. Це настає через 48 годин, знаменуючи початок третьої фази.

Фаза молочнокислих паличок. У ній панівне становище набувають паличкоподібних форм молочнокислих бактерій. ( L. lactis, L. crusei, L. bulgaricumта ін.). Утворюється кислої реакції середовища призводить до пригнічення росту та поступового відмирання інших видів бактерій.

До кінця третьої фази подальші можливості розвитку молочнокислої мікрофлори вичерпуються, але в зміну приходять грибки, котрим молочна кислота служить поживним субстратом.

Фаза грибкової мікрофлори. У цей період розвиваються плісняви та дріжджі, життєдіяльність яких призводить до втрати продуктом своєї харчової цінності. Дріжджі представлені головним чином видами з роду Torula, Рідше виявляються деякі види сахароміцетів.

З плісняв зустрічаються: молочна пліснява ( Oidium lactis), що покриває у вигляді гармата поверхню кислого молока і сметани, а також аспергілові, пеніцилові та мукорові.

Дія грибкової флори веде до нейтралізації середовища, а це робить його знову придатним для бактерій. Настає розвиток гнильних бактерій, що викликають протеоліз казеїну, і, нарешті, групи анаеробних спороутворюючих маслянокислих бактерій.

Діяльність мікрофлори, що змінюється, припиняється тільки з настанням повної мінералізації всіх органічних речовин молока.

За деяких умов процес зміни мікробних біоценозів може відхилятися від наведеної вище схеми. Так, молочнокислі бактерії можуть бути від початку пригнічені мікробами групи кишкових паличок, якщо останні присутні у великій кількості. Дріжджі можуть виробляти помітні концентрації спирту, що є у таких продуктах, як кефір (0,2–0,6%) і, особливо, кумис (0,9–2,5%). Наявність спирту створює умови для подальшого розвитку оцтовокислих бактерій, що зброджують спирт в оцтову кислоту. Наявність у молоці антибіотиків та інших інгібуючих та нейтралізуючих мікрофлору речовин також може уповільнювати молочнокислі процеси.