Схема фазово-контрастного мікроскопа.
1. Кільце конденсера
2. Предметна площина
3. Фазова платівка
4. Первинне зображення.
На відміну від опорного світла, розсіяне на зразку предметне світло, в областях, зображених синім, мине фазову пластинку, таким чином довжина його оптичного шляху інша

Фазово-контрастна мікроскопія- метод отримання зображень в оптичних мікроскопах, при якому зсув фаз електромагнітної хвилі трансформується у контраст інтенсивності. Фазовоконтрастну мікроскопію відкрив Фріц Церніке, за що отримав Нобелівську премію за 1953 рік.

Принцип дії

Для отримання фазовоконтрастного зображення світло від джерела розбивається на два когерентні світлові промені, один з них називають опорним, інший предметним, які проходять різні оптичні шляхи. Мікроскоп юстують таким чином, щоб у фокальній площині, де формується зображення, інтерференція між цими двома променями гасила їх.

Зображення клітини у фазово-контрастному мікроскопі

Довжину оптичного шляху змінюють за допомогою так званої фазової платівки (англ.)російська. , розташованої на фазовому кільці Коли шляху одного з променів перебуває зразок, заломлення світла у ньому змінює оптичний шлях, отже, і фазу, що змінює умови інтерференції.

Фазово-контрастна мікроскопія особливо популярна в біології, оскільки не вимагає попереднього фарбування клітини, через яку вона може загинути.

Історія відкриття

Голландський фізик, математик і хімік Фріц Церніке в 1930 почав працювати в галузі оптики. Цього ж року він відкрив фазово-контрастний метод. Протягом 1930-1940-х років Цернике зробив свій внесок і в інших питаннях оптики, тоді як фазово-контрастний метод не був помічений широкими колами вчених. Новий метод залишався поза увагою наукової спільноти аж до Другої світової війни, коли під час німецької окупації Голландії відкриття Церніке було використане для створення перших фазово-контрастних мікроскопів. Протягом війни багато виробників стали випускати фазово-контрастні мікроскопи, і вони стали широко застосовуватися в біологічних та медичних дослідженнях.

Посилання

Джерела

Wikimedia Foundation. 2010 .

Дивитись що таке "Фазово-контрастна мікроскопія" в інших словниках:

Див. Мікроскопія у фазово контрастному мікроскопі. (Джерело: «Словник термінів мікробіології») … Словник мікробіології

Метод мікроскопічного дослідження, заснований на отриманні за допомогою спеціальних пристроїв контрастного зображення структурних безбарвних прозорих мікрооб'єктів, що розрізняються по щільності, наприклад живих мікроорганізмів і тканинних …

ФАЗОВО-КОНТРАСТНА МІКРОСКОПІЯ- фазово контрастна мікроскопія, див. Мікроскоп, Мікроскопічна техніка... Ветеринарний енциклопедичний словник

фазово-контрастна оптична мікроскопія- 4.34 фазово контрастна оптична мікроскопія (phase contrast optical microscopy): Метод мікроскопічного аналізу, заснований на перетворенні диференціальних фазових зрушень світлових хвиль, що проходять через зразок, на відміну амплітуд. Словник-довідник термінів нормативно-технічної документації

М. живих незабарвлених об'єктів, при якій контрастність зображення підвищують шляхом перетворення фазових відмінностей того, що пройшло крізь об'єкт пучка світлових променів в амплітудні … Великий медичний словник

Загальна назва методів спостереження в мікроскоп нерозрізнених людським оком об'єктів. Детальніше див. у ст. (Див. МІКРОСКОП). Фізичний енциклопедичний словник. М: Радянська енциклопедія. Головний редактор А. М. Прохоров. 1983 р. … Фізична енциклопедія

Сукупність методів вивчення малих об'єктів з допомогою мікроскопів. До традиційних видів М. відносяться-люмінесцентна М. - заснована на явищі фотолюмінесценції, що виникає при фарбуванні препаратів спеціальними люмінесцентними барвниками; Словник мікробіології

Схема темнопольної мікроскопії в світлі. Підсвічування зразка здійснюється збоку (зелена лінія). Зображення створюється світлом, що розсіюється на неоднорідності зразка. Темнопільна мікроскопія вид оптичн … Вікіпедія

Метод дослідження головним чином живих малоконтрастних об'єктів (найпростіших, бактерій, клітин у культурі) за допомогою аноптрального мікроскопа (винайдений у 1953 фінським фізіологом А. Вільска) різновиду фазово контрастного мікроскопа. Велика Радянська Енциклопедія

Методи вивчення різних об'єктів за допомогою мікроскопа. У біології та медицині ці методи дозволяють вивчати будову мікроскопічних об'єктів, розміри яких лежать за межами роздільної здатності ока людини. Основу М.М.І. складає… … Медична енциклопедія

1.Методи мікроскопії (люмінесцентна, темнопольна, фазово-контрастна, електронна).

Люмінесцентна мікроскопіязаснована на здатності ряду речовин біологічного походження або деяких барвників світитися під дією світла, що падає на них. Мікроорганізми, що містять хлорофіл, вітамін В12, алкалоїди, деякі антибіотики, мають первинну люмінесценцію. Клітини мікроорганізмів, у яких люмінесценція слабко виражена чи відсутня, обробляють спеціальними барвниками - флуорохромами (акридиновий помаранчевий, примулін, родамін та інших.) як сильно розбавлених водних розчинів: 1:500 -1:100000. Такі розчини слабко токсичні, що дозволяє вивчати неушкоджену клітину.

Темнопільна мікроскопіязаснована на освітленні об'єкта косими променями світла (ефект Тіндаля). При такому освітленні промені не потрапляють до об'єктиву, тому поле зору виглядає темним. Якщо в досліджуваному препараті містяться клітини мікроорганізмів, то косі промені відбиваються від поверхні, відхиляються від свого початкового напрями і потрапляють в об'єктив. На інтенсивно чорному тлі видно сяючі об'єкти. Таке освітлення препарату досягається використанням спеціального конденсора темнопольного, яким замінюють звичайний конденсор світлопольного мікроскопа.

При мікроскопуванні в темному полі можна побачити об'єкти, величина яких вимірюється сотими частками мікрометра, що знаходиться за межами роздільної здатності звичайного світлопольного мікроскопа. Однак спостереження за об'єктами у темному полі дозволяє досліджувати лише контури клітин та не дає можливості розглянути їхню внутрішню структуру.

Фазово-контрастна мікроскопіяцінна насамперед тим, що з її допомогою можна спостерігати живі об'єкти, які мають коефіцієнти заломлення, близькі до коефіцієнтів заломлення середовища. З точки зору збільшення зображення об'єкта, жодного виграшу не відбувається, проте прозорі об'єкти видно більш чітко, ніж у світлі звичайного світлопольного мікроскопа. За відсутності спеціального мікроскопа звичайний світловий може бути оснащений спеціальним фазово-контрастним пристроєм, який переводить фазові зміни світлових хвиль, що проходять через об'єкт в амплітудні. Внаслідок цього живі прозорі об'єкти стають контрастними та видними у полі зору.

За допомогою фазово-контрастної мікроскопії вивчають форму, розміри, взаємне розташування клітин, їх рухливість, розмноження, проростання спор мікроорганізмів тощо.

засновану на перетворенні невидимих ​​фазових змін світлових хвиль, що вносяться об'єктом, в амплітудні, помітні оком.

Електронна мікроскопія. Дозволяє спостерігати об'єкти, розміри яких лежать за межами роздільної здатності світлового мікроскопа (0,2 мкм). Електронний мікроскоп застосовується для вивчення вірусів, тонкої будови різних мікроорганізмів, макромолекулярних структур та інших субмікроскопічних об'єктів.

Звичайний електронний мікроскоп, що просвічує, схожий на світловий, за тим винятком, що об'єкт опромінюється не світловим потоком, а пучком електронів, що генерується спеціальним електронним прожектором. Отримане зображення проеціюється на люмінесцентний екран за допомогою системи лінз. Збільшення електронного мікроскопа, що просвічує, може досягати мільйона, однак, для атомно-силових мікроскопів і це не межа.

Фазово-контрастний мікроскоп значно підвищує контрастність об'єктів, проникних світла, й у медицині використовується вивчення нативних препаратів. З допомогою цього можуть бути досліджені без попередньої обробки безбарвні, прозорі об'єкти, деталі, будова яких оптично мало різняться між собою.

Забарвлені препарати частково поглинають світло. Пучок світла, що проходить через такий препарат, втрачає свою інтенсивність, тобто. зменшується амплітуда світлової хвилі, і це легко вловлюється оком дослідника. Такі препарати контрастні навіть у звичайному мікроскопі і називаються "амплітудними". Препарати, що не поглинають світла, прозорі. Пучок світла, що проходить через такий препарат, не втрачає своєї інтенсивності. Амплітуда світлової хвилі не змінюється, лише змінюється фаза коливання, що реєструється людським оком. Такі об'єкти називаються фазовими. До них належать живі, незабарвлені препарати. Щоб підвищити контрастність зображення, необхідно перетворити фазові зміни на амплітудні. Це досягається шляхом приміщення в об'єктиви фазової пластинки у формі кільця та застосуванням кільцевої діафрагми. Кожному об'єктиву відповідає своя діафрагма. Зображення цієї діафрагми збігається з кільцем фазової платівки відповідного об'єктива. Метод фазових контрастів може бути позитивним та негативним. У першому випадку на світлому тлі поля спостерігається темне зображення об'єкта, а у другому тло темне, а об'єкт світлий. Найкращі результати спостерігаються у разі позитивного розмаїття.

Поширення світлових хвиль у прозорих однорідних об'єктах не супроводжується втратою інтенсивності світла. Змінюється лише швидкість проходження світлового потоку через об'єкт у порівнянні зі швидкістю поширення світла у навколишньому середовищі. Вона буде більшою або меншою залежно від того, чи буде показник світлозаломлення об'єкта відповідно меншим або більшим, ніж у навколишньому середовищі. Ці зміни, звані інакше фазовими, оскільки за них змінюються лише фаза коливань минулого світла, характерні більшості біологічних об'єктів (живих клітин, зрізів тканин тощо. п.).

Людське око добре визначає зміни інтенсивності світла, що настають при проходженні через пофарбовані (амплітудні) препарати, коли змінюється амплітуда коливань світла. Однак око не здатне сприймати фазові зміни світла. Тому прозорі неконтрастні (фазові) об'єкти за звичайного мікроскопічного дослідження залишаються невидимими.

Для роботи за методом фазового розмаїття потрібно, крім звичайного біологічного мікроскопа, мати ще спеціальний пристрій. Установку пристрою роблять наступним чином. Конденсор та об'єктив замінюють фазовими. Фазовий конденсор поворотом револьверного диска встановлюють на 0. Це положення відповідає звичайному світлопольному конденсору. Потім помістивши на предметний столик препарат і сфокусувавши його, приступають до налагодження освітлення. При дослідженні методом фазового розмаїття основною умовою є оптимальна освітленість, яка досягається встановленням світла Келером. Після цього встановлюють револьверний диск те число, яке відповідає обраному об'єктиву; наприклад, при об'єктиві ´40 у віконці також встановлюють цифру 40. Вийнявши окуляр, на його місце встановлюють допоміжний мікроскоп і налаштовують його на зображення двох кілець (кільцева діафрагма конденсора та фазова пластинка). Центрувальним пристроєм конденсора домагаються поєднання кілець. Замінивши допоміжний мікроскоп окуляром, можна проводити дослідження препарату.

Метод аноптрального розмаїття є удосконаленням методу фазового розмаїття. Теоретичні обґрунтування та конструктивні особливості аноптрального пристрою, в основному, не відрізняються від звичайної фазово-контрастної установки (рис. 6). Принцип його устрою полягає в наступному. На верхню поверхню передостанньої лінзи імерсійного об'єктива наноситься кільце з сажі, що пропускає лише близько 10% світла, що проходить. У передній фокальній площині конденсора міститься кільцева діафрагма, зображення якої має повністю збігатися з кільцем сажі на об'єктиві. Препарат висвітлюється повним конусом променів, що проходять через кільцеву діафрагму конденсора. За відсутності об'єктів (наприклад, мікробів у препараті) в об'єктив потрапляють лише недифраговані промені, амплітуда яких після того, як вони пройдуть через кільце сажі, зменшиться на 90%. У той же час амплітуда променів, дифрагованих частинками об'єкта, які пройдуть повз кільця з сажі, не зміниться і тому фон поля буде темним, а частинки об'єкта світлими. Перевагою методу аноптральної мікроскопії є велика здатність об'єктивів і можливість виявлення мінімальних оптичних різниць щільності в незабарвлених препаратах. Чим більша оптична щільність об'єкта, тим світліше його зображення. Методика використання пристрою не відрізняється від фазово-контрастного. За допомогою аноптрального мікроскопа можна вивчати морфологію та локалізацію нуклеоїдів (ядерний апарат), спостерігати за змінами морфології бактерій у процесі нормального росту та розмноження.

Інформація про фазово-контрастний мікроскоп

До програми навчання у середній школі біології входять спостереження клітин щоки. Для цього учень за допомогою плоскої зубочистки акуратно зіскребує шар із внутрішньої поверхні щоки. Зразок поміщається на предметне скло та накривається кришкою. Клітини щоки – епітеліальні та розглядаються у великих кількостях. Якщо додати зразок краплю йоду, ядра клітин будуть більш помітні. Вони будуть виглядати як невеликі круглі крапки всередині клітини. Знімок зліва демонструє, як виглядають клітини без йоду під звичайним мікроскопом. На правому ви бачите той самий зразок при розгляді у фазово-контрастному мікроскопі (насправді використовувався той самий мікроскоп, але під іншим кутом). Ці знімки наочно демонструють значне підвищення якості зображення деяких зразків під час використання фазово-контрастного мікроскопа.

Що таке фазовий контраст?

Фазово-контрастним називається метод, розроблений на початку 20 століття Фріцем Церніке (Frits Zernike). Цернике виявив, що, якщо прискорити проходження світла по прямій, можна викликати деструктивну інтерференцію моделі в зображенні. Ці моделі роблять зображення детальнішим, виділяючи елементи на світлому тлі. Щоб викликати інтерференцію моделей, Цернік розробив систему кілець, розташованих як у лінзі об'єктива, так і в конденсаторі. При правильному юстуванні світлові хвилі, що випускаються джерелом світла, потрапляють в око зі зміщенням по фазі? довжина хвилі. Зображення зразка стає значно кращим. Метод придатний тільки для тих зразків, які не поглинають світло (вони називаються "фазовими об'єктами"), і відмінно підходить для розгляду деталей деяких зразків, таких як частини найпростіших клітин, бактерій, джгутиків сперми та інших клітин, що не поглинають світло. Цей метод виявився настільки прогресивним для мікроскопії, що Церніку було присуджено Нобелівську премію з фізики 1953 року. Біографію Фріца Церніке можна знайти.

Встановлює мікроскоп для фазово-контрастних спостережень.

Щоб налаштувати мікроскоп на спостережень методом фазового розмаїття, Вам потрібні фазово-контрастні об'єктивні лінзи та фазово-контрастний конденсатор.

Не всі фазово-контрастні мікроскопи однакові, але в основному вони використовують аналогічні методи налаштування системи для отримання оптимальних результатів. У системі, показаній праворуч, фазовий конденсатор має п'ять положень (10x, 20x, 40x, 100x та BF) BF – "brightfield" – без фаз. Щоб налаштувати мікроскоп із фазовою оптикою, спочатку встановіть його в положення BF і сфокусуйте на зразку. Відрегулюйте висоту конденсатора, щоб отримати найкраще зображення. Потім встановіть конденсатор у положення, що відповідає лінзі, та приберіть зразок. Регулятори з обох боків задньої стінки конденсатора призначені для центрування.

/ Бадяєва Є.Є. // Вибрані питання судово-медичної експертизи. - Хабаровськ, 2018 - №17 . - С. 34-37.

КДБУЗ «Бюро судово-медичної експертизи» міністерства охорони здоров'я Хабаровського краю (поч. – к.м.н. А.В. Нестеров), м. Хабаровськ

Використання методики фазово-контрастної мікроскопії для встановлення крововиливів на гнильно змінених тканинах

бібліографічний опис:
Використання методики фазово-контрастної мікроскопії для встановлення крововиливів на гнилісно змінених тканинах / Бадяєва О.Є. // Вибрані питання судово-медичної експертизи. - Хабаровськ, 2018. - №17. - С. 34-37.

html код:
/ Бадяєва Є.Є. // Вибрані питання судово-медичної експертизи. - Хабаровськ, 2018. - №17. - С. 34-37.

код для вставки на форум:
Використання методики фазово-контрастної мікроскопії для встановлення крововиливів на гнилісно змінених тканинах / Бадяєва О.Є. // Вибрані питання судово-медичної експертизи. - Хабаровськ, 2018. - №17. - С. 34-37.

wiki:
/ Бадяєва Є.Є. // Вибрані питання судово-медичної експертизи. - Хабаровськ, 2018. - №17. - С. 34-37.

Визначення прижиттєвості та давності утворення механічних ушкоджень є однією з актуальних проблем судової медицини. Якщо тканини трупа перебувають у стані гнильних змін, діагностика прижиттєвості та давності утворення крововиливів багаторазово ускладнюється. Це з змінами, що відбуваються під впливом протеолітичних ферментів. При аутолізі відзначається набухання цитоплазми клітин, збільшення її абсолютних розмірів, ядра клітин стають світлішими та зменшуються в розмірах. У міру подальшого набухання цитоплазми межі клітин стають нечіткими, цитоплазма набуває зернистого вигляду. Процес набухання клітин змінюється їх зморщуванням і зменшенням абсолютних розмірів, при цьому збільшується інтенсивність сприйняття цитоплазмою кислих барвників.

У стані виражених гнильних змін клітина втрачає здатність до фарбування.

Мікроскопію препаратів з аутолітичними та гнильними змінами проводять під малим та великим збільшенням для виявлення характерних структур та визначення приналежності тканин та органів, представлених на дослідження.

У шкірі аутолітичні зміни, перш за все, виникають у залізистих утвореннях шкіри (сальних та потових залозах), потім в епідермісі. Волокнисті структури стійкіші до аутолізу. В епідермісі відзначається нечіткість меж між клітинами, базофілія цитоплазми, бліде забарвлення ядер.

У скелетній мускулатурі в міру дозволу трупного задублення виявляються аутолітичні зміни у вигляді помутніння, зернистості та гомогенізації міоплазми. Ядра в цьому випадку піддаються лізису.

У судинах відзначається розпушення та набухання інтими. Ядра пікнотичні чи лізовані. В еритроцитах вилуговується гемоглобін і вони слабо забарвлюються еозином, контури їх деякий час зберігаються, потім є сітчасті структури, а при виході глікогену контури еритроцитів не відрізняються.

Судово-медичне значення гістологічного дослідження гнильно змінених тканин обмежується не тільки визначенням органної та тканинної приналежності, а й можливістю визначення прижиттєвості крововиливів. Для виявлення крововиливів у гнильних тканинах використовується методика фарбування по Лепені. Дана методика заснована на виявленні пероксидазної активності гемоглобіну в тканинах шляхом фарбування зрізів розчином бензидину і перекису водню, еритроцити та гемоглобін при даному забарвленні повинні забарвитися темно-коричневий колір. На практиці гемоглобіновий пігмент фарбується у жовто-коричневий, буро-коричневий, жовто-зелений кольори. Цитоплазма фарбується в блідо-сіро-блакитний і блідо-бежевий колір. При різко виражених гнильних змінах тканин, рясній гнильній бактеріальній і грибковій мікрофлорі може бути отримана помилково-негативна реакція по Лепені (негативне забарвлення при крововиливі). Таким чином, в даний час немає досконалих методик, що дозволяють виявляти крововилив у тканинах, схильних до гнильних змін.

Нами отримано позитивний досвід застосування фазово-контрастної мікроскопії при дослідженні крововиливів на гнильно змінених тканинах. Застосування цього методу дозволяє виявити як наявність у тканинах крововиливів, а й ступінь їх виразності. Метод фазового розмаїття заснований на тому, що фазова швидкість світла обернено пропорційна показнику заломлення. Фаза променя, що проходить через об'єкт з більш високим показником заломлення, ніж у навколишнього середовища, буде запізнюватися в порівнянні з фазою променя, який проходить тільки через середовище. Око не здатне сприймати фазові зміни світла. Тому прозорі, неконтрастні об'єкти за звичайного мікроскопічного дослідження залишаються невидимими. У фазово-контрастному мікроскопі спеціальний конденсор і особливо влаштований об'єктив регулюють зміни фази світлових хвиль і перетворюють різницю фаз на різницю інтенсивностей світла, завдяки чому деталі будови об'єкта стають доступними для ока. Система кілець у конденсорі та об'єктиві відокремлює ті промені, які діафрагмували (відхилилися) на об'єкті, від тих, що не діафрагмували. Після того, як діафрагмували промені проходять через фазову пластинку об'єктива, що вносить додатковий зсув по фазі, вони рекомбінуються з променями, що недіафрагмували. Саме в такий спосіб вдається різко підвищити контраст клітин чи внутрішньоклітинних структур. При гнильних змін тканин фазово-контрастна мікроскопія дозволяє полегшити визначення належності тканин, їхню структуру.

Рис.1. Осередок геморагічного просочування в проміжній стромі. Забарвлення гематоксилін-еозином (ліворуч).

Рис.1. Осередок геморагічного просочування в проміжній стромі. Забарвлення по Лепені (праворуч)

Рис. 2. Осередок геморагічного просочування в проміжній стромі.
Фазово-контрастна мікроскопія

У листопаді 2018 року до лабораторії надійшов матеріал із трупа, який перебував у землі з 2017 року. Його органи та тканини перебували у стані виражених гнильних змін. При стандартному забарвленні тканин і органів в одному з мікропрепаратів виявлені вогнища бурого фарбування, що нагадують крововилив. Волокнисті структури були забарвлені в брудно-рожево-бузковий колір, клітинно-ядерна будова не визначалося, в колі розширених і повнокровних судин середнього калібру були відзначені дрібні вогнища геморагічного просочування в проміжній стромі поза зв'язками з судинами. Реакція по Лепені була представлена ​​у вигляді осередкових блідо-коричневих дрібнозернистих мас, слабо помітних на загальному світло-жовтому фоні (рис. 1). При фазово-контрастній мікроскопії крововиливи були представлені зернистими масами, які добре контурувалися по відношенню до навколишніх тканин (рис. 2).

Даний приклад наочно показує, що фазово-контрастне дослідження в гнильно змінених та пошкоджених тканинах допомагає:

визначити розташування крововиливів у тканині;

визначити обсяг інфільтрації тканин еритроцитами (прижиттєвість).

Застосування даного методу дозволяє економити на забарвленнях мікропрепаратів, замінюючи їх використання фазово-контрастним методом, що в умовах недостатнього фінансування гістологічних відділень дозволяє розставити пріоритети при планових закупівлях матеріалів і реагентів.