Схема на фазово-контрастен микроскоп.
1. Кондензаторен пръстен
2. Предметна равнина
3. Фазова плоча
4. Първичен образ.
За разлика от еталонната светлина, светлината на обекта, разпръсната върху пробата, в областите, изобразени в синьо, заобикаля фазовата плоча, така че дължината на нейния оптичен път е различна

Фазова контрастна микроскопия- метод за получаване на изображения в оптични микроскопи, при който фазовото изместване на електромагнитната вълна се трансформира в контраст на интензитета. Фазово-контрастната микроскопия е открита от Фриц Зернике, за което той получава Нобелова награда през 1953 г.

Принцип на работа

За да се получи фазово-контрастно изображение, светлината от източника се разделя на два кохерентни светлинни лъча, единият от които се нарича референтен, а другият е обектът, които преминават през различни оптични пътища. Микроскопът се настройва така, че във фокалната равнина, където се формира изображението, интерференцията между двата лъча ги неутрализира.

Изображение на клетка във фазово-контрастен микроскоп

Дължината на оптичния път се променя с помощта на така наречената фазова плоча (Английски)Руски разположен на фазовия пръстен. Когато образец е на пътя на един от лъчите, пречупването на светлината в него променя оптичния път и следователно фазата, което променя условията на интерференция.

Фазово-контрастната микроскопия е особено популярна в биологията, тъй като не изисква предварително оцветяване на клетката, което може да доведе до нейната смърт.

История на откритията

Холандският физик, математик и химик Фриц Зернике започва работа в областта на оптиката през 1930 г. През същата година той открива метода на фазовия контраст. През 30-те и 40-те години на миналия век Зернике има принос в други аспекти на оптиката, докато методът на фазовия контраст не е забелязан от широк кръг учени. Новият метод остава извън научната общност до Втората световна война, когато по време на германската окупация на Холандия откритието на Цернике е използвано за създаването на първите фазово-контрастни микроскопи. По време на войната много производители започнаха да произвеждат фазово-контрастни микроскопи и те станаха широко използвани в биологични и медицински изследвания.

Връзки

Източници

Фондация Уикимедия. 2010 г.

Вижте какво е "фазова контрастна микроскопия" в други речници:

Вижте Микроскопия под фазово-контрастен микроскоп. (Източник: Речник на термините в микробиологията) ... Речник по микробиология

Микроскопски метод за изследване, базиран на получаване с помощта на специални устройства на контрастно изображение на структури от безцветни прозрачни микрообекти с различна плътност, например живи микроорганизми и тъкани ...

ФАЗОВО КОНТРАСТНА МИКРОСКОПИЯ- фазово контрастна микроскопия, вижте Микроскоп, Микроскопска техника ... Ветеринарен енциклопедичен речник

оптична микроскопия с фазов контраст- 4.34 метод за оптична микроскопия с фазов контраст за микроскопски анализ, базиран на преобразуването на диференциалните фазови отмествания на светлинните вълни, преминаващи през проба, в разлики в амплитудите. ... ... Речник-справочник на термините на нормативната и техническата документация

М. живи небоядисани обекти, в които контрастът на изображението се увеличава чрез преобразуване на фазовите разлики на лъча светлинни лъчи, преминали през обекта, в амплитуда ... Голям медицински речник

Общото наименование на методите за наблюдение на обекти, неразличими от човешкото око през микроскоп. Вижте чл. (вижте МИКРОСКОП). Физически енциклопедичен речник. Москва: Съветска енциклопедия. Главен редактор А. М. Прохоров. 1983... Физическа енциклопедия

Набор от методи за изследване на малки обекти с помощта на микроскопи. Традиционните видове М. включват - луминесцентни М. - базирани на явлението фотолуминесценция, което възниква при оцветяване на препарати със специални луминесцентни багрила; ... ... Речник по микробиология

Схема на микроскопия в тъмно поле при падаща светлина. Пробата се осветява отстрани (зелена линия). Изображението се създава от светлина, разсеяна от нередности в пробата. Микроскопски изглед в тъмно поле на оптична ... Wikipedia

Метод за изследване предимно на живи обекти с нисък контраст (протозои, бактерии, клетки в култура) с помощта на аноптален микроскоп (изобретен през 1953 г. от финландския физиолог А. Вилска), вид фазово-контрастен микроскоп ... Велика съветска енциклопедия

Начини за изследване на различни обекти с помощта на микроскоп. В биологията и медицината тези методи позволяват да се изследва структурата на микроскопични обекти, чиито размери са извън разделителната способност на човешкото око. Основата на M.m.i. съставляваща…… Медицинска енциклопедия

1. Методи на микроскопия (флуоресцентна, тъмнополева, фазово-контрастна, електронна).

Флуоресцентна микроскопиясе основава на способността на редица вещества от биологичен произход или някои багрила да светят под действието на падаща върху тях светлина. Микроорганизмите, съдържащи хлорофил, витамин В12, алкалоиди, някои антибиотици, имат първична луминесценция. Клетките на микроорганизмите, в които луминесценцията е слабо изразена или липсва, се третират със специални багрила - флуорохроми (акридин оранжево, примулин, родамин и др.) Под формата на силно разредени водни разтвори: 1: 500 -1: 100 000. Такива разтвори са слабо токсични, което прави възможно изследването на непокътната клетка.

Микроскопия в тъмно полевъз основа на осветяване на обект с наклонени лъчи светлина (ефект на Тиндал). При такова осветление лъчите не влизат в обектива, така че зрителното поле изглежда тъмно. Ако тестовият препарат съдържа клетки от микроорганизми, тогава косите лъчи се отразяват от тяхната повърхност, отклоняват се от първоначалната си посока и влизат в лещата. Блестящите обекти се виждат на наситено черен фон. Такова осветяване на препарата се постига чрез използване на специален кондензатор за тъмно поле, който замества конвенционалния кондензатор на микроскоп със светло поле.

Когато микроскопирате в тъмно поле, можете да видите обекти, чийто размер се измерва в стотни от микрометъра, което е извън разделителната способност на конвенционален микроскоп със светло поле. Наблюдението на обекти в тъмно поле обаче дава възможност да се изследват само контурите на клетките и не дава възможност да се изследва тяхната вътрешна структура.

Фазова контрастна микроскопияе ценен преди всичко, защото може да се използва за наблюдение на живи обекти, които имат показатели на пречупване, близки до тези на средата. Няма печалба по отношение на увеличаването на изображението на обекта, но прозрачните обекти се виждат по-ясно, отколкото в пропуснатата светлина на конвенционален микроскоп със светло поле. При липса на специален микроскоп обикновеният светлинен микроскоп може да бъде оборудван със специално фазово-контрастно устройство, което преобразува фазовите промени на светлинните вълни, преминаващи през обект, в амплитудни промени. В резултат на това живите прозрачни обекти стават контрастни и видими в зрителното поле.

С помощта на фазово-контрастна микроскопия се изследват формата, размерите, взаимното разположение на клетките, тяхната подвижност, размножаване, покълване на спори на микроорганизми и др.

въз основа на трансформацията на невидимите фазови промени на светлинните вълни, въведени от обект, в амплитудни промени, които са видими за окото.

електронна микроскопия. Позволява ви да наблюдавате обекти, чиито размери са извън разделителната способност на светлинен микроскоп (0,2 микрона). Електронният микроскоп се използва за изследване на вируси, фината структура на различни микроорганизми, макромолекулни структури и други субмикроскопични обекти.

Конвенционалният трансмисионен електронен микроскоп е подобен на светлинния микроскоп, с изключение на това, че обектът се облъчва не от светлинен поток, а от електронен лъч, генериран от специален електронен проектор. Полученото изображение се проектира върху флуоресцентен екран с помощта на система от лещи. Увеличението на трансмисионния електронен микроскоп може да достигне милион, но за атомните силови микроскопи това не е ограничението.

Фазово-контрастният микроскоп значително увеличава контраста на прозрачни за светлина обекти и се използва в медицината за изследване на нативни препарати. С помощта на този метод могат да се изследват без предварителна обработка безцветни, прозрачни обекти, детайли, чиято структура оптически се различава малко един от друг.

Цветните препарати частично абсорбират светлината. Светлинен лъч, преминаващ през такъв препарат, губи своя интензитет, т.е. амплитудата на светлинната вълна намалява и това лесно се улавя от окото на изследователя. Такива препарати са контрастни дори в конвенционален микроскоп и се наричат ​​„амплитудни“. Препаратите, които не абсорбират светлина, са прозрачни. Лъч светлина, преминаващ през такъв препарат, не губи своята интензивност. Амплитудата на светлинната вълна не се променя, а се променя само фазата на трептенето, което не се регистрира от човешкото око. Такива обекти се наричат ​​фазови обекти. Те включват живи, неоцветени препарати. За да увеличите контраста на изображението, е необходимо фазовите промени да се превърнат в амплитудни. Това се постига чрез поставяне на пръстеновидна фазова пластина в обективите и използване на пръстеновидна диафрагма. Всеки обектив има собствена бленда. Изображението на тази диафрагма съвпада с пръстена на фазовата плоча на съответния обектив. Методът на фазовия контраст може да бъде положителен или отрицателен. В първия случай се наблюдава тъмен образ на обекта на фона на светло поле, докато във втория случай фонът е тъмен, а обектът е светъл. Най-добри резултати се наблюдават при положителен контраст.

Разпространението на светлинни вълни в прозрачни хомогенни обекти не е придружено от загуба на интензитет на светлината. Променя се само скоростта на преминаване на светлинния поток през обекта спрямо скоростта на разпространение на светлината в околната среда. Той ще бъде по-голям или по-малък в зависимост от това дали индексът на пречупване на обекта е съответно по-малък или по-голям от този в околната среда. Тези промени, иначе наречени фазови промени, тъй като променят само фазата на предаваните светлинни трептения, са характерни за повечето биологични обекти (живи клетки, тъканни участъци и др.).

Човешкото око добре определя промените в интензитета на светлината, които възникват при преминаване през цветни (амплитудни) препарати, когато амплитудата на светлинните трептения се променя. Въпреки това, окото не е в състояние да възприема фазовите промени в светлината. Следователно прозрачните неконтрастни (фазови) обекти остават невидими по време на конвенционалното микроскопско изследване.

За да работите по метода на фазовия контраст, е необходимо освен обичайния биологичен микроскоп да имате специално устройство. Устройството се инсталира по следния начин. Кондензаторът и лещата се сменят с фазови. Чрез завъртане на въртящия се диск фазовият кондензатор се настройва на 0. Тази позиция съответства на конвенционален кондензатор със светло поле. След това, поставяйки препарата върху предметната маса и фокусирайки го, започват да регулират осветеността. При изследване по метода на фазовия контраст основното условие е оптималното осветление, което се постига чрез настройка на светлината според Koehler. След това настройте въртящия се диск на номера, който съответства на избрания обектив; например при обектив ´40 в прозореца се поставя и числото 40. След отстраняване на окуляра на негово място се монтира спомагателен микроскоп и се настройва да изобразява два пръстена (пръстеновидната диафрагма на кондензатора и фазовата пластина) . Центриращото устройство на кондензатора постига центровка на пръстените. Чрез замяната на спомагателния микроскоп с окуляр е възможно изследването на препарата.

Методът на аноптралния контраст е подобрение на метода на фазовия контраст. Теоретичните обосновки и конструктивните характеристики на аноптралното устройство по принцип не се различават от обичайната фазово-контрастна настройка (фиг. 6). Принципът на неговото устройство е следният. Върху горната повърхност на предпоследната леща на имерсионен обектив е поставен пръстен от сажди, който пропуска само около 10% от пропуснатата светлина. В предната фокална равнина на кондензатора е поставена пръстеновидна диафрагма, чието изображение трябва напълно да съвпада с пръстена от сажди върху обектива. Препаратът се осветява от пълен конус от лъчи, преминаващи през пръстеновидната диафрагма на кондензатора. При липса на обекти (например микроби в препарата) в лещата влизат само недифрактирани лъчи, чиято амплитуда след преминаване през пръстена на саждите ще намалее с 90%. В същото време амплитудата на лъчите, дифрактирани от частиците на обекта, които преминават през пръстена на саждите, няма да се промени и следователно фонът на полето ще бъде тъмен, докато частиците на обекта ще бъдат светли. Предимството на анопталната микроскопия е високата разделителна способност на обективите и възможността за откриване на минимални разлики в оптичната плътност в неоцветени препарати. Колкото по-голяма е оптичната плътност на даден обект, толкова по-ярко е изображението му. Методът на използване на устройството не се различава от фазово-контрастния. С помощта на аноптален микроскоп може да се изследва морфологията и локализацията на нуклеоидите (ядрен апарат), да се наблюдават промени в морфологията на бактериите по време на нормален растеж и възпроизводство.

Относно фазово-контрастния микроскоп

Наблюденията на клетките на бузите са част от учебната програма на гимназията по биология. За да направите това, ученикът, използвайки плоска клечка за зъби, внимателно изстъргва слоя от вътрешната повърхност на бузата. Пробата се поставя върху предметно стъкло и се покрива с капак. Клетките на бузите са епителни и се наблюдават в големи количества. Ако към пробата се добави капка йод, клетъчните ядра ще бъдат по-видими. Те ще изглеждат като малки кръгли точки вътре в клетката. Картината вляво показва как изглеждат клетките без йод под обикновен микроскоп. Вдясно виждате същата проба, когато се гледа под микроскоп с фазов контраст (всъщност е използван същият микроскоп, но от различен ъгъл). Тези изображения ясно демонстрират значителното подобрение в качеството на изображението на някои проби при използване на фазово-контрастен микроскоп.

Какво е фазов контраст?

Фазовият контраст е метод, разработен в началото на 20 век от Фриц Зернике. Зернике установи, че чрез ускоряване на преминаването на светлината по права линия е възможно да се предизвика разрушителна намеса на модела във въпросното изображение. Тези модели правят изображението по-подробно, като подчертават елементи на светъл фон. За да причини смущения на модела, Zernike разработи система от пръстени, разположени както в лещата на обектива, така и в кондензатора. Когато са правилно подравнени, светлинните вълни, излъчвани от светлинния източник, влизат в окото с фазово изместване от ? дължина на вълната. Изображението на пробата става много по-добро. Методът е подходящ само за проби, които не абсорбират светлина (наречени „фазови обекти“) и е отличен за разглеждане на детайли на някои проби, като части от протозойни клетки, бактерии, флагели на сперматозоиди и други клетки, които не абсорбират светлина . Този метод се оказва толкова напреднал за микроскопията, че Зернике получава Нобелова награда за физика през 1953 г. Може да се намери биография на Фриц Зернике.

Инсталиране на микроскоп за фазово-контрастни наблюдения.

За да настроите микроскоп за наблюдения на фазов контраст, имате нужда от обективни лещи с фазов контраст и кондензатор за фазов контраст.

Не всички фазово-контрастни микроскопи са еднакви, но като цяло те използват подобни методи за настройка на системата за оптимални резултати. В системата, показана вдясно, фазовият кондензатор има пет позиции (10x, 20x, 40x, 100x и BF) BF - "светло поле" - без фази. За да настроите микроскоп с фазова оптика, първо го поставете в позиция BF и фокусирайте върху образеца. Регулирайте височината на кондензатора за най-добро изображение. След това поставете кондензатора в позиция, съответстваща на лещата, и извадете пробата. Регулаторите от двете страни на задната стена на кондензатора са проектирани да го центрират.

/ Бадяева Е.Е. // Избрани въпроси на съдебно-медицинската експертиза. - Хабаровск, 2018 г. - № 17. - С. 34-37.

KGBUZ "Бюро за съдебномедицинска експертиза" на Министерството на здравеопазването на Хабаровския край (начало - кандидат на медицинските науки А. В. Нестеров), Хабаровск

Използване на фазово-контрастна микроскопия за установяване на кръвоизливи върху гнилостни тъкани

библиографско описание:
Използването на фазово-контрастна микроскопия за установяване на кръвоизливи върху гнилостни тъкани / Badyaeva E.E. // Избрани проблеми на съдебно-медицинската експертиза. - Хабаровск, 2018. - № 17. - С. 34-37.

html код:
/ Бадяева Е.Е. // Избрани проблеми на съдебно-медицинската експертиза. - Хабаровск, 2018. - № 17. - С. 34-37.

код за вграждане във форума:
Използването на фазово-контрастна микроскопия за установяване на кръвоизливи върху гнилостни тъкани / Badyaeva E.E. // Избрани проблеми на съдебно-медицинската експертиза. - Хабаровск, 2018. - № 17. - С. 34-37.

уики:
/ Бадяева Е.Е. // Избрани проблеми на съдебно-медицинската експертиза. - Хабаровск, 2018. - № 17. - С. 34-37.

Определянето на продължителността на живота и давността на образуването на механични повреди е един от неотложните проблеми на съдебната медицина. Ако тъканите на трупа са в състояние на гнилостни промени, диагнозата на живота и предписването на образуването на кръвоизлив става много по-сложна. Това се дължи на промените, настъпващи под въздействието на протеолитичните ензими. По време на автолизата има подуване на клетъчната цитоплазма, увеличаване на нейния абсолютен размер, клетъчните ядра стават по-леки и намаляват по размер. Тъй като цитоплазмата набъбва допълнително, клетъчните граници стават неясни, цитоплазмата придобива гранулиран вид. Процесът на набъбване на клетките се заменя с тяхното набръчкване и намаляване на техния абсолютен размер, докато интензивността на възприемането на киселинни багрила от цитоплазмата се увеличава.

В състояние на изразени гнилостни промени клетката губи способността си да оцветява.

Микроскопията на препарати с автолитични и гнилостни промени се извършва при ниско и голямо увеличение за идентифициране на характерни структури и определяне на принадлежността на тъканите и органите, предоставени за изследване.

В кожата автолитичните промени се появяват предимно в жлезистите образувания на кожата (мастни и потни жлези), след това в епидермиса. Влакнестите структури са по-устойчиви на автолиза. В епидермиса има размита граница между клетките, базофилия на цитоплазмата и бледо оцветяване на ядрата.

В скелетните мускули, когато rigor mortis отзвучава, се откриват автолитични промени под формата на мътност, грануларност и хомогенизиране на миоплазмата. Ядрата в този случай се подлагат на лизис.

В съдовете се отбелязва разхлабване и подуване на интимата. Ядрата са пикнотични или лизирани. В еритроцитите хемоглобинът се измива и те са слабо оцветени с еозин, контурите им се запазват за известно време, след това са мрежести структури, а когато се освободи гликоген, контурите на еритроцитите не се различават.

Съдебномедицинското значение на хистологичното изследване на гнилостни тъкани е ограничено не само от определянето на органната и тъканната принадлежност, но и от възможността за определяне на продължителността на кръвоизливите. За откриване на кръвоизливи в гнилостни тъкани се използва техниката на оцветяване с Лепин. Тази техника се основава на откриване на активността на хемоглобин пероксидазата в тъканите чрез оцветяване на срезове с разтвор на бензидин и водороден пероксид; еритроцитите и хемоглобинът трябва да станат тъмнокафяви с това оцветяване. На практика хемоглобиновият пигмент се оцветява в жълто-кафяво, кафяво-кафяво, жълто-зелено. Цитоплазмата е оцветена в бледо сиво-синьо и бледо бежово. При изразени гнилостни промени в тъканите, обилна гнилостна бактериална и гъбична микрофлора може да се получи фалшиво отрицателна реакция според Lepen (отрицателен цвят при кръвоизлив). По този начин в момента няма идеални методи за откриване на кръвоизливи в тъкани, подложени на гнилостни промени.

Получихме положителен опит в използването на фазово-контрастна микроскопия при изследване на кръвоизливи върху гнилостни тъкани. Използването на този метод позволява да се идентифицира не само наличието на кръвоизливи в тъканите, но и степента на тяхната тежест. Методът на фазовия контраст се основава на факта, че фазовата скорост на светлината е обратно пропорционална на индекса на пречупване. Фазата на лъч, преминаващ през обект с по-висок индекс на пречупване от този на околната среда, ще се забави в сравнение с фазата на лъч, който преминава само през средата. Окото не е в състояние да възприема фазовите промени на светлината. Поради това прозрачните, неконтрастни обекти остават невидими по време на конвенционалното микроскопско изследване. Във фазово-контрастен микроскоп специален кондензатор и специално проектирана леща регулират промените във фазата на светлинните вълни и преобразуват фазовата разлика в разлика в интензитета на светлината, така че детайлите на структурата на обекта стават достъпни за окото. . Системата от пръстени в кондензатора и обектива разделя онези лъчи, които са блокирани (отклонени) върху обекта, от тези, които не са. След като апертурните лъчи преминат през фазовата плоча на обектива, което въвежда допълнително фазово изместване, те се рекомбинират с недиафрагмираните лъчи. Именно по този начин е възможно рязко да се увеличи контрастът на клетките или вътреклетъчните структури. При гнилостни промени в тъканите фазово-контрастната микроскопия улеснява определянето на принадлежността на тъканите, тяхната структура.

Фиг. 1. Фокусът на хеморагичното импрегниране в интерстициалната строма. Оцветяване с хематоксилин-еозин (вляво).

Фиг. 1. Фокусът на хеморагичното импрегниране в интерстициалната строма. Лепин петно ​​(вдясно)

Ориз. 2. Фокус на хеморагична импрегнация в интерстициалната строма.
Фазова контрастна микроскопия

През ноември 2018 г. в лабораторията е получен материал от труп, който е бил в земята от 2017 г. Органите и тъканите му са били в състояние на изразени гнилостни изменения. При стандартно оцветяване на тъкани и органи един от микропрепаратите разкрива огнища на кафеникаво оцветяване, наподобяващи кръвоизливи. Влакнестите структури бяха оцветени в мръсен розово-лилав цвят, клетъчно-ядрената структура не беше определена, малки огнища на хеморагична импрегнация в интерстициалната строма, извън връзката със съдовете, бяха отбелязани в кръга на разширена и пълнокръвна среда -размерени съдове. Реакцията по Лепин се представя под формата на фокални бледокафяви дребнозърнести маси, слабо различими на общ светложълт фон (фиг. 1). При фазово-контрастна микроскопия кръвоизливите са представени от гранулирани маси, които са добре контурирани по отношение на околните тъкани (фиг. 2).

Този пример ясно показва, че изследването с фазов контраст в гнилостни и увредени тъкани помага:

определяне на местоположението на кръвоизливи в тъканта;

определя обема на тъканната инфилтрация от еритроцитите (жизненост).

Използването на този метод също така позволява да се спести от оцветяването на микропрепаратите, като се замени използването им с фазово-контрастен метод, което в контекста на недостатъчното финансиране на хистологичните отделения дава възможност да се приоритизират планираните покупки на материали и реактиви.