Схема фазово-контрастного микроскопа.
1. Кольцо конденсера
2. Предметная плоскость
3. Фазовая пластинка
4. Первичное изображение.
В отличие от опорного света, рассеянный на образце предметный свет, в областях, изображённых синим, минует фазовую пластинку, таким образом длина его оптического пути другая

Фазово-контрастная микроскопия - метод получения изображений в оптических микроскопах , при котором сдвиг фаз электромагнитной волны трансформируется в контраст интенсивности. Фазовоконтрастную микроскопию открыл Фриц Цернике , за что получил Нобелевскую премию за 1953 год .

Принцип действия

Для получения фазовоконтрастного изображения свет от источника разбивается на два когерентных световых луча, один из них называют опорным, другой предметным, которые проходят разные оптические пути . Микроскоп юстируют таким образом, чтобы в фокальной плоскости, где формируется изображение, интерференция между этими двумя лучами гасила бы их.

Изображение клетки в фазово-контрастном микроскопе

Длину оптического пути изменяют с помощью так называемой фазовой пластинки (англ.) русск. , расположенной на фазовом кольце. Когда на пути одного из лучей находится образец, преломление света в нём изменяет оптический путь, а, следовательно, и фазу, что изменяет условия интерференции.

Фазово-контрастная микроскопия особенно популярна в биологии, поскольку не требует предварительного окрашивания клетки , из-за которого та может погибнуть.

История открытия

Голландский физик, математик и химик Фриц Цернике в 1930 году начал работать в области оптики. В этом же году он открыл фазово-контрастный метод. В течение 1930-1940-х годов Цернике внёс свой вклад и в других вопросах оптики, в то время как фазово-контрастный метод не был замечен широкими кругами учёных. Новый метод оставался вне поля зрения научного сообщества вплоть до Второй мировой войны , когда во время немецкой оккупации Голландии открытие Цернике было использовано для создания первых фазово-контрастных микроскопов. В течение войны многие производители стали выпускать фазово-контрастные микроскопы, и они стали широко применяться в биологических и медицинских исследованиях.

Ссылки

Источники

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Фазово-контрастная микроскопия" в других словарях:

См. Микроскопия в фазово контрастном микроскопе. (Источник: «Словарь терминов микробиологии») … Словарь микробиологии

Метод микроскопического исследования, основанный на получении с помощью специальных приспособлений контрастного изображения различающихся по плотности структур бесцветных прозрачных микрообъектов, например живых микроорганизмов и тканевых …

ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ - фазово контрастная микроскопия, см. Микроскоп, Микроскопическая техника … Ветеринарный энциклопедический словарь

фазово-контрастная оптическая микроскопия - 4.34 фазово контрастная оптическая микроскопия (phase contrast optical microscopy): Метод микроскопического анализа, основанный на преобразовании дифференциальных фазовых сдвигов световых волн, проходящих через образец, в различие амплитуд.… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

М. живых неокрашенных объектов, при которой контрастность изображения повышают путем превращения фазовых различий прошедшего сквозь объект пучка световых лучей в амплитудные … Большой медицинский словарь

Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

Совокупность методов изучения малых объектов с помощью микроскопов. К традиционным видам М. относятся–люминесцентная М. – основана на явлении фотолюминесценции, возникающей при окраске препаратов специальными люминесцентными красителями;… … Словарь микробиологии

Схема темнопольной микроскопии в падающем свете. Подсветка образца осуществляется сбоку (зеленая линия). Изображение создается светом, рассеивающимся на неоднородностях образца. Темнопольная микроскопия вид оптическ … Википедия

Метод исследования главным образом живых малоконтрастных объектов (простейших, бактерий, клеток в культуре) посредством аноптрального микроскопа (изобретён в 1953 финским физиологом А. Вильска) разновидности фазово контрастного микроскопа … Большая советская энциклопедия

Способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет… … Медицинская энциклопедия

1.Методы микроскопии (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная).

Люминесцентная микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться под действием падающего на них света. Микроорганизмы, содержащие хлорофилл, витамин В12, алкалоиды, некоторые антибиотики, обладают первичной люминесценцией. Клетки микроорганизмов, в которых люминесценция слабо выражена или отсутствует, обрабатывают специальными красителями - флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500 -1:100000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку.

Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света (эффект Тиндаля). При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если в исследуемом препарате содержатся клетки микроорганизмов, то косые лучи отражаются от их поверхности, отклоняются от своего первоначального направления и попадают в объектив. На интенсивно черном фоне видны сияющие объекты. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора, которым заменяют обычный конденсор светлопольного микроскопа.

При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.

Фазово-контрастная микроскопия ценна прежде всего тем, что с ее помощью можно наблюдать живые объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. С точки зрения увеличения изображения объекта, никакого выигрыша не происходит, однако прозрачные объекты видны более четко, чем в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа. При отсутствии специального микроскопа обычный световой может быть оснащен специальным фазово-контрастным устройством, которое переводит фазовые изменения световых волн, проходящих через объект в амплитудные. В результате этого живые прозрачные объекты становятся контрастными и видными в поле зрения.

С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д.

основанную на превращении невидимых фазовых изменений световых волн, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.

Электронная микроскопия . Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способно¬сти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.

Обычный просвечивающий электронный микроскоп похож на световой, за тем исключением, что объект облучается не световым потоком, а пучком электронов, генерируемым специальным электронным прожектором. Полученное изображение проецируется на люминесцентный экран с помощью системы линз. Увеличение просвечивающего электронного микроскопа может достигать миллиона, однако, для атомно-силовых микроскопов и это не предел.

Фазово-контрастный микроскоп значительно повышает контра­стность объектов, проницаемых для света, и в медицине ис­пользуется для изучения нативных препаратов. С помощью этого метода могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты, детали, строение которых оп­тически мало различаются между собой.

Окрашенные препараты частично поглощают свет. Пучок света, проходящий через такой препарат, теряет в своей ин­тенсивности, т.е. уменьшается амплитуда световой волны, и это легко улавливается глазом исследователя. Такие препараты контрастны даже в обычном микроскопе и называются “амплитуд­ными”. Препараты, не поглощающие света, прозрачны. Пучок света, проходящий через такой препарат, не теряет своей ин­тенсивности. Амплитуда световой волны не изменяется, а лишь изменяется фаза колебания, что не регистрируется человече­ским глазом. Такие объекты называются фазовыми. К ним отно­сятся живые, неокрашенные препараты. Чтобы повысить контра­стность изображения, необходимо превратить фазовые изменения в амплитудные. Это достигается путем помещения в объективы фазовой пластинки в форме кольца и применением кольцевой диафрагмы. Каждому объективу соответствует своя диафрагма. Изображение этой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пла­стинки соответствующего объектива. Метод фазовых контрастов может быть положительным и отрицательным. В первом случае на светлом фоне поля наблюдается темное изображение объекта, а во втором фон темный, а объект светлый. Наилучшие результаты наблюдаются в случае положительного контраста.

Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Ме­няется только скорость прохождения светового потока через объект по сравнению со скоростью распространения света в окружающей среде. Она будет большей или меньшей в зависимости от того, будет ли показатель светопреломления объекта соответственно меньше или больше, чем в окружающей среде. Эти изменения, называе­мые иначе фазовыми, так как при них меняются только фаза ко­лебаний прошедшего света, характерны для большинства биоло­гических объектов (живых клеток, срезов тканей и т. п.).

Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсив­ности света, наступающие при прохождении через окрашенные (амплитудные) препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Однако глаз не способен воспринимать фазовые измене­ния света. Поэтому прозрачные неконтрастные (фазовые) объ­екты при обычном микроскопическом исследовании остаются не­видимыми.

Для работы по методу фазового контраста нужно, кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Установку устройства производят следующим обра­зом. Конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конден­сор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светопольному конденсору. Затем, поместив на предметный столик препарат и сфокусировав его, приступают к наладке освещения. При исследовании мето­дом фазового контраста основным условием является оптималь­ная освещенность, которая достигается установкой света по Келеру. После этого устанавливают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу; например, при объективе ´40 в окошечке также устанавливают цифру 40. Вынув окуляр, на его место устанавливают вспомогательный микроскоп и настраивают его на изображение двух колец (коль­цевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Центро­вочным устройством конденсора добиваются совмещения колец. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, можно произво­дить исследование препарата.

Метод аноптрального контраста является усовершенствованием метода фазового контраста. Теоретические обоснования и конструктивные особенности аноптрального устройства, в основном не отличаются от обычной фазово-контрастной установки (рис. 6). Принцип его устройства заключается в следующем. На верхнюю поверхность предпоследней линзы иммерсионного объектива наносится кольцо из сажи, пропускающей лишь около 10% проходящего света. В передней фокальной плоскости кон­денсора помещается кольцевая диафрагма, изображение которой должно полностью совпадать с кольцом сажи на объективе. Пре­парат освещается полным конусом лучей, проходящих через кольцевую диафрагму конденсора. При отсутствии объектов (например, микробов в препарате) в объектив попадают только недифрагированные лучи, амплитуда которых, после того как они пройдут через кольцо сажи, уменьшится на 90%. В то же время амплитуда лучей, дифрагированных частицами объекта, которые пройдут мимо кольца из сажи, не изменится и поэтому фон поля будет темный, а частицы объекта светлыми. Пре­имуществом метода аноптральной микроскопии является боль­шая разрешающая способность объективов и возможность выяв­ления минимальных оптических разностей плотности в неокра­шенных препаратах. Чем больше оптическая плотность объекта, тем светлее его изображение. Методика использования устрой­ства не отличается от фазово-контрастного. При помощи аноптрального микроскопа можно изучать морфо­логию и локализацию нуклеоидов (ядерный аппарат), наблюдать за изменениями морфологии бактерий в процессе нормального роста и размножения.

Информация о фазово-контрастном микроскопе

В программу обучения в средней школе биологии входят наблюдения клеток щеки. Для этого учащийся при помощи плоской зубочистки аккуратно соскребывает слой с внутренней поверхности щеки. Образец помещается на предметное стекло и накрывается крышкой. Клетки щеки – эпителиальные и рассматриваются в больших количествах. Если в образец добавить каплю йода, ядра клеток будут более заметны. Они будут выглядеть как небольшие круглые точки внутри клетки. Снимок слева демонстрирует, как выглядят клетки без йода под обычным микроскопом. На правом вы видите тот же образец при рассмотрении в фазово-контрастном микроскопе (на самом деле использовался тот же микроскоп, но под другим углом). Эти снимки наглядно демонстрируют значительное повышение качества изображения некоторых образцов при использовании фазово-контрастного микроскопа.

Что такое фазовый контраст?

Фазово-контрастным называется метод, разработанный в начале 20 века Фрицем Цернике (Frits Zernike). Цернике обнаружил, что, если ускорить прохождение света по прямой, можно вызвать деструктивную интерференцию модели в рассматриваемом изображении. Эти модели делают изображение более детальным, выделяя элементы на светлом фоне. Чтобы вызвать интерференцию моделей, Цернике разработал систему колец, расположенных как в линзе объектива, так и в конденсаторе. При правильной юстировке световые волны, испускаемые источником света, попадают в глаз со смещением по фазе на? длины волны. Изображение образца становится значительно лучше. Метод пригоден только для тех образцов, которые не поглощают свет (они называются "фазовыми объектами"), и отлично подходит для рассмотрения деталей некоторых образцов, таких как части клеток простейших, бактерий, жгутиков спермы и других клеток, не поглощающих свет. Этот метод оказался настолько прогрессивным для микроскопии, что Цернике была присуждена Нобелевская премия по физике 1953 года. Биографию Фрица Цернике можно найти .

Установка микроскопа для фазово-контрастных наблюдений.

Чтобы настроить микроскоп на наблюдений методом фазового контраста, Вам необходимы фазово-контрастные объективные линзы и фазово-контрастный конденсатор.

Не все фазово-контрастные микроскопы одинаковы, но, в основном, они используют аналогичные методы настройки системы для получения оптимальных результатов. В системе, показанной справа, фазовый конденсатор имеет пять положений (10x, 20x, 40x, 100x и BF) BF – "brightfield" – без фаз. Для настройки микроскопа с фазовой оптикой сначала установите его в положение BF и сфокусируйте на образце. Отрегулируйте высоту конденсатора для получения наилучшего изображения. Затем установите конденсатор в положение, соответствующее линзе, и уберите образец. Регуляторы с обеих сторон задней стенки конденсатора предназначены для его центрирования.

/ Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018 — №17 . — С. 34-37.

КГБУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» министерства здравоохранения Хабаровского края (нач. – к.м.н. А.В. Нестеров), г. Хабаровск

Использование методики фазово-контрастной микроскопии для установления кровоизлияний на гнилостно измененных тканях

библиографическое описание:
Использование методики фазово-контрастной микроскопии для установления кровоизлияний на гнилостно измененных тканях / Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

html код:
/ Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

код для вставки на форум:
Использование методики фазово-контрастной микроскопии для установления кровоизлияний на гнилостно измененных тканях / Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

wiki:
/ Бадяева Е.Е. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. - Хабаровск, 2018. — №17. — С. 34-37.

Определение прижизненности и давности образования механических повреждений является одной из актуальных проблем судебной медицины. Если ткани трупа находятся в состоянии гнилостных изменений, диагностика прижизненности и давности образования кровоизлияний многократно усложняется. Это связано с изменениями, происходящими под воздействием протеолитических ферментов. При аутолизе отмечается набухание цитоплазмы клеток, увеличение ее абсолютных размеров, ядра клеток становятся светлее и уменьшаются в размерах. По мере дальнейшего набухания цитоплазмы границы клеток становятся нечеткими, цитоплазма приобретает зернистый вид. Процесс набухания клеток сменяется их сморщиванием и уменьшением их абсолютных размеров, при этом увеличивается интенсивность восприятия цитоплазмой кислых красителей.

В состоянии выраженных гнилостных изменений клетка утрачивает способность к окрашиванию.

Микроскопию препаратов с аутолитическими и гнилостными изменениями проводят под малым и большим увеличением для выявления характерных структур и определения принадлежности тканей и органов, представленных на исследование.

В коже аутолитические изменения, прежде всего, возникают в железистых образованиях кожи (сальных и потовых железах), затем в эпидермисе. Волокнистые структуры более устойчивы к аутолизу. В эпидермисе отмечается нечеткость границ между клетками, базофилия цитоплазмы, бледная окраска ядер.

В скелетной мускулатуре по мере разрешения трупного окоченения выявляются аутолитические изменения в виде помутнения, зернистости и гомогенизация миоплазмы. Ядра в данном случае подвергаются лизису.

В сосудах отмечается разрыхление и набухание интимы. Ядра пикнотичные либо лизированные. В эритроцитах выщелачивается гемоглобин и они слабо окрашиваются эозином, контуры их некоторое время сохраняются, затем представляют собой сетчатые структуры, а при выходе гликогена контуры эритроцитов не различаются.

Судебно-медицинское значение гистологического исследования гнилостно изменённых тканей ограничивается не только определением органной и тканевой принадлежности, но и возможностью определения прижизненности кровоизлияний. Для выявления кровоизлияний в гнилостных тканях используется методика окраски по Лепене. Данная методика основана на выявлении пероксидазной активности гемоглобина в тканях путем окрашивания срезов раствором бензидина и перекиси водорода, эритроциты и гемоглобин при данной окраске должны окраситься в темно-коричневый цвет. На практике гемоглобиновый пигмент красится в желто-коричневый, буро-коричневый, желто-зеленый цвета. Цитоплазма красится в бледно-серо-голубой и бледнобежевой цвет. При резко выраженных гнилостных изменениях тканей, обильной гнилостной бактериальной и грибковой микрофлоре может быть получена ложноотрицательная реакция по Лепене (отрицательная окраска при имеющем место кровоизлиянии). Таким образом, в настоящее время нет совершенных методик, позволяющих выявлять кровоизлияния в тканях, подверженных гнилостным изменениям.

Нами получен положительный опыт применения фазово-контрастной микроскопии при исследовании кровоизлияний на гнилостно измененных тканях. Применение данного метода позволяет выявить не только наличие в тканях кровоизлияний, но и степень их выраженности. Метод фазового контраста основан на том, что фазовая скорость света обратно пропорциональна показателю преломления. Фаза луча, проходящего через объект с более высоким показателем преломления, чем у окружающей среды, будет запаздывать по сравнению с фазой того луча, который проходит только через среду. Глаз не способен воспринимать фазовые изменения света. Поэтому прозрачные, неконтрастные объекты при обычном микроскопическом исследовании остаются невидимыми. В фазово-контрастном микроскопе специальный конденсор и особо устроенный объектив регулируют изменения фазы световых волн и превращают разность фаз в разность интенсивностей света, благодаря чему детали строения объекта становятся доступными для глаза. Система колец в конденсоре и объективе отделяет те лучи, которые диафрагмировали (отклонились) на объекте, от тех, которые не диафрагмировали. После того как диафрагмировавшие лучи проходят через фазовую пластинку объектива, вносящую дополнительный сдвиг по фазе, они рекомбинируются с недиафрагмировавшими лучами. Именно таким образом удается резко повысить контраст клеток или внутриклеточных структур. При гнилостных изменениях тканей фазово-контрастная микроскопия позволяет облегчить определение принадлежности тканей, их структуру.

Рис.1. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме. Окраска гематоксилин-эозином (слева).

Рис.1. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме. Окраска по Лепене (справа)

Рис. 2. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме.
Фазово-контрастная микроскопия

В ноябре 2018 года в лабораторию поступил материал из трупа, который находился в земле с 2017 года. Его органы и ткани находились в состоянии выраженных гнилостных изменений. При стандартной окраске тканей и органов в одном из микропрепаратов обнаружены очаги буроватого прокрашивания, напоминающие кровоизлияния. Волокнистые структуры были окрашены в грязно-розовато-сиреневый цвет, клеточно-ядерное строение не определялось, в окружности расширенных и полнокровных сосудов среднего калибра были отмечены мелкие очажки геморрагического пропитывания в межуточной строме, вне связи с сосудами. Реакция по Лепене была представлена в виде очаговых бледно-коричневых мелкозернистых масс, слабо различимых на общем светложелтом фоне (рис. 1). При фазово-контрастной микроскопии кровоизлияния были представлены зернистыми массами, которые хорошо контурировались по отношению к окружающим тканям (рис. 2).

Данный пример наглядно показывает, что фазово-контрастное исследование в гнилостно измененных и поврежденных тканях помогает:

определить расположение кровоизлияний в ткани;

определить объем инфильтрации тканей эритроцитами (прижизненность).

Применение данного метода также позволяет экономить на окрасках микропрепаратов, заменяя их использование фазово-контрастным методом, что в условиях недостаточного финансирования гистологических отделений позволяет расставить приоритеты при плановых закупках материалов и реагентов.