PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин) є зазвичай використовується буфером для імуногістохімічного фарбування і зазвичай використовується в біологічних дослідженнях. Концентрація осмолярності та іонів розчинів відповідає концентрації людського тіла (ізотонічної).

PBS є розчином на водній основі, що містить гідрофосфат натрію, хлорид натрію і, в деяких випадках, хлорид калію і дигідрофосфат калію.

Імунофлуоресцентне фарбування для IHC

Імунофлуоресцентне фарбування було першим методом імуногістохімічного (IHC) фарбування. З основою реакції зв'язування антиген антитіло антигени стають видимими з використанням флуоресцентних барвників при кон'югуванні з антитілами. Процес відбувається, коли активується збуджуючим світлом певної довжини хвилі під флуоресцентним мікроскопом. Імуногістохімія відноситься до процесу виявлення антигенів (наприклад, білків) у клітинах тканинної секції з використанням принципу антитіл, що специфічно зв'язуються з антигенами в біологічних тканинах.

Використання забуференого фосфатом сольового розчину (PBS)

Забуферений фосфатом фізіологічний розчин має багато застосувань, оскільки він ізотонічний та не токсичний для більшості клітин. Його можна використовувати для розведення речовин та використовується для промивання контейнерів, що містять клітини. PBS можна використовувати як розріджувач у методах сушіння біомолекул, оскільки молекули води всередині нього будуть структуровані навколо речовини (наприклад, білка), щоб його «висушували» та іммобілізували до твердої поверхні.

Тонка плівка води, яка зв'язується з речовиною, запобігає денатурації або іншим конформаційним змінам. Карбонатні буфери можуть використовуватися з тією самою метою, але з меншою ефективністю. PBS також може використовуватися для отримання еталонного спектра при вимірюванні адсорбції білка еліпсометрії.

Приготування PBS

Існує багато різних способів приготування PBS.

Деякі формули не містять калію, а інші містять кальцій або магній. Рецепт буфера нижче, який відносно простий, для вихідного 10X розчину PBS (0,1 М). Також надається можливість додавання Tween. Весь процес займає близько 10 хвилин.

Як зробити фосфатний буферний сольовий розчин (PBS)

1. Зважте наступне: 10. 9 г безводного двоосновного фосфату натрію (Na2HPO4), 3,2 г безводного фосфату одноосновного натрію (NaH2PO4) і 90 г хлориду натрію (NaCl).
2. Розчинити все вищезгадане тільки в 1 л дистильованої води.
3. Відрегулюйте pH до 7. 4.
4. Зробіть розчин до кінцевого об'єму 1 л.
5. (не обов'язково). Для розчину, що містить 0,5% Tween 20, додайте 5 мл Tween 20 розчин 1L.
6. Розбавте 10X перед використанням та за необхідності відрегулюйте pH.

• Зберігати за кімнатної температури.
• Нестегнові реагенти можуть бути заміщені, але вам доведеться перерахувати відповідну масу кожного, щоб розмістити молекули доданої води.

Що вам потрібне для створення буфера PBS

• Однофазний фосфат натрію (безводний)
• Двоосновний фосфат натрію (безводний)
• Натрій хлорид
• Масштаб та вагові човни
• Магнітна мішалка та мішалка > pH-зонд, калібровані та відповідні розчини для регулювання рН
• 1 л мірної колби
• Tween 20 (необов'язково)

Застосування

Натрій-фосфатний буфер знаходить широке застосування, оскільки є ізотонічним та нетоксичним для клітин. PBS використовують для розчинення речовин, для ополіскування контейнерів, що містять клітини.

Приготування

Існує багато способів виготовлення натрій-фосфатного буфера. Деякі формули не містять калію, інші містять кальцій чи магній.

Для приготування 1 літра одноразового буфера натрій-фосфатного використовують:

• 8,00 г NaCl
• 0,20 г KCl
• 1,44 г Na 2 HPO 4
• 0,24 г KH 2 PO 4
• розчиняють у 800 мл дистильованої води
• доводять рН до 7,4 соляною кислотою або гідроксидом натрію.
• додають дистильованої води до 1 літра.

Десять літрів 10-кратного PBS розчину можна приготувати розчинивши 800 г NaCl, 20 г KCl, 144 г Na 2 HPO 4 і 24 г KH 2 PO 4 у восьми літрах дистильованої води, довівши далі об'єм до десяти літрів. рН розчину, що вийшов, буде приблизно 6,8, але після розведення до одноразового PBS стане рівним 7,4. Після приготування розчину слід перевірити значення рН за допомогою рН-метра. При необхідності можна скоригувати рН за допомогою соляної кислоти або гідроксиду натрію .

Найбільш простим способом приготування натрійфосфатного буфера є використання комерційно доступних таблетованих препаратів. Такі таблетки розводять дистильованою водою до заданого об'єму та одержують розчин заданої концентрації.

Для клітинних культур розчин повинен бути розлитий на аліквоти та стерилізований автоклавуванням (20 хвилин при 121 °C, в режимі рідини). Стерилізація не є необхідною залежно від особливостей використання. Можливе зберігання натрій-фосфатного буфера за кімнатної температури, проте для запобігання розмноженню бактерій тривале зберігання нестерильного буфера рекомендують здійснювати в холодильнику. Солі в концентрованих стокових розчинах при охолодженні можуть випадати в осад, тому перед застосуванням рекомендують нагріти концентрований розчин до кімнатної температури та дочекатися повного розчинення осаду.

Примітки

Див. також

Wikimedia Foundation. 2010 .

Вимоги до огорожі та підготовки біологічного матеріалу для проведення гематологічних досліджень.

Вимоги до транспортування та зберігання біологічного матеріалу для проведення гематологічних досліджень.

Правильне заповнення напрямку дослідження системи гемостазу:

П.І.Б., вік, стать пацієнта

Час забору крові для дослідження

Клінічний діагноз (коротко)

Гематокрит

Геморагічний синдром (носові, маткові кровотечі та ін.), тромбоз (вказати локалізацію), шок, поліорганна недостатність, травми, синдром тривалого здавлення, опік та ін.)

Вказати прийняті ліки, що впливають на параметри гемостазу із зазначенням дозування, способу та терміну останнього введення

Дотримуються часовий інтервал забору зразка (крові), дієтичні та навантажувальні органічення:

Плановий забір крові проводять з 7 до 9 години ранку, в положенні пацієнта лежачи або сидячи. При дослідженні гемостазу у поступовій динаміці забір крові бажано проводити у тому положенні тіла, як і попередній забір.

Кров беруть натще, через 12-14 годин після останнього прийому їжі.

Перед забором крові бажаним є відпочинок пацієнта протягом 15 хвилин.

Винятки:дослідження гемостазу з cito, оцінка АЧТВ.

Напередодні планового дослідження (протягом 24 годин) пацієнт утримується від значних фізичних навантажень, алкоголю. Бажано, щоб напередодні забору крові пацієнт не вживав жирної їжі.

Оперативне втручання призводить до зміни показників гемостазу на строк від кількох днів до декількох тижнів.

До факторів, що впливають на гемостаз відносяться ін'єкції, вливання, переливання, пункції, біопсії, масаж, діаліз, введення рентгеноконтрастних засобів, імуносцинтіографія, іоізуюче випромінювання, ендоскопічне дослідження, спеціальні дієти.

ПРАВИЛА ЗАБОРУ КРОВІ

Кров беруть з периферичної вени (частіше ліктьової).

Забір крові проводиться тільки з використанням вакуумної системи забору в пробірки зі спеціальним кольоровим маркуванням залежно від антикоагулянту, що використовується ( цитрат натрію 3,2%)у співвідношенні: 1 об'єм цитрату натрію до 9 об'ємів крові.

Для дослідження рівня тромбоцитівкров беруть у пробірку з ЕДТА(бузкове кольорове маркування). Дослідження рівня тромбоцитів призначають за відсутності клінічного аналізу крові або при отриманні клінічного аналізу крові патологічних значень рівня тромбоцитів

Допустимо короткочасне накладення джгута, не більше ніж на 60 секунд. Джгут зніміть відразу після того, як голка увійшла до вени. Для забору крові на дослідження системи згортання важливо, що не можна масажувати вени, стукати по них.

Використовуйте голку для забору крові із внутрішнім діаметром 0,7-1 мм (розмір 19-22).

Використання шприца неприпустиме через активацію тромбоцитів та факторів згортання крові турбулентним рухом крові та її змішування з повітрям (спінювання). Воно виключається при використанні вакуумних контейнерів.

Після введення голки у вену приєднайте вакуумний контейнер, кров почне надходити в контейнер самопливом.

Кров для коагулологічного дослідження беріть у другуПершу пробірку використовуйте для інших досліджень, наприклад, біохімічних. Якщо першою повинна бути набрана пробірка, призначена для дослідження системи згортання, перші 5 мл крові наберіть в порожню пробірку і викиньте, щоб запобігти попаданню в пробу тканинного тромбопластину.

Кров негайно після акуратно перемішайте без спінювання з антикоагулянтом (переверніть пробірку 3-4 рази).

Після забору біологічного матеріалу перевірте зразок крові. Акуратна перевірка зразків крові дозволяє уникнути таких помилок: неправильне співвідношення обсягів кров/цитрат; кров, що частково згорнулася.

Кров доставляють до лабораторії протягом 45 хвилин після її забору. При транспортуванні кров не можна трусити. Не можна допускати транспортування зразків крові при температурі менше 4°С та вище 30°С.

Фельдшер-лаборант (медичний технолог) здійснює:

вхідний контроль доставленої крові, що включає: 1) перевірку правильності заповнення направного бланка. 2)перевірку достатності доставленого об'єму крові за міткою на пробірці; 3) перевірку зразка на відсутність згустків при повільному нахилі пробірки.

центрифугування доставленої крові з метою одержання:

багатої тромбоцитами плазми (параметри центрифугування: кількість обертів за хвилину = 1000 об/хв (близько 150-200g), час центрифугування 5-7 хвилин.

Для вибору оптимальних умов центрифугування орієнтуються відцентрову силу (g). Можна скористатися формулою:

g = 1,118 х 0,00001r х n2,

де г - радіус центрифуги - відстань у сантиметрах між віссю ротора та центром пробірки у гнізді центрифуги; п - число обертів за хвилину.

бідною тромбоцитами плазми (параметри центрифугування: кількість обертів за хвилину = ~2500-3000 об/хв (близько 1500-2000g), час центрифугування 10-20 хвилин. Для повного видалення тромбоцитів проводиться повторне центрифугування, параметри центрифугування залишаються незмінними.

3. Після центрифугування перевіряє плазму на колір та прозорість: гемолізований зразок, іктерична або ліпемічна (хілезна) плазма дослідженню не підлягають.

Після центрифугування відбирає супернатант.

Бажанодослідити показники гемостазу протягом 2 години після взяття крові, але допускається дослідження коагулологічних показників у протягом 4 годин , якщо плазма була відокремлена від осаду еритроцитів та лейкоцитів.

За потреби тривалого зберігання«свіжі» проби (не пізніше 2 годин після забору крові) безтромбоцитної плазмиможна одноразово заморозитита зберігати до 2 тижнів при температурі -20°С або до 6 місяців при температурі -70°С. Розморожувати плазму треба швидко у теплій воді (+36°С), ретельно перемішати та негайно досліджувати. Після заморожування можлива зміна АЧТП.

Методика приготування мікропрепаратів для гематологічних досліджень, методи фіксації та фарбування.

Методика виготовлення мазків крові для гематологічних досліджень.

Підготовка та обробка скла. Нове чисте скло може використовуватися після знежирення в суміші Никифорова (рівні частини 96% етилового спирту та ефіру). Використане скло замочується протягом доби в теплому мильному розчині або розчині прального порошку (1 столова ложка порошку на 5 л води). Через добу розчин зливають, промивають скла проточною водою. Потім їх знову заливають теплим мильним розчином або розчином прального порошку і доводять до кипіння, кип'ятять у цьому ж розчині 5-10 хв (не більше, щоб уникнути помутніння скла). Після охолодження розчину його знову зливають, прополіскують скло проточною водою і кожне скло промивають щіткою під проточною водою. Оброблені таким чином скла розкладають на чистому простирадлі для висихання. Чисте скло для знежирення поміщають у суміш Нікіфорова або 96% етиловий спирт на 60 хв, потім витирають насухо і зберігають у чистому посуді з широким горлом. Чисте скло рекомендується брати або пінцетом, або руками за бічні краї.

Приготування мазків. На підготовлене сухе предметне скло ближче до короткої сторони наносять скляною паличкою (або безпосередньо з місця уколу пальця) невелику краплю крові. Залишають скло в горизонтальному положенні і розмазують кров по склу за допомогою чистого сухого шліфованого скла, тримаючи його під кутом 45°. Коротким рубом, зачекавши, доки вся кров не розпливеться по ньому, швидко проводять по предметному склу. Сильно натискати на предметне скло не слід, оскільки це може спричинити пошкодження формених елементів крові. Мазки висушують на повітрі і маркують (краще простим олівцем). Висохлий мазок повинен бути рівномірно тонким, жовтуватого кольору, достатньої величини, розташовуватися на відстані 1,0-1,5 см від країв скла, займати майже всю довжину скла і закінчуватися "метелонькою". Товсті (густо-рожевого кольору) мазки використовувати не слід, тому що в них морфологія клітин важко розрізнити.

Стандартні якісні мазки виходять при використанні автоматичних пристроїв, призначених для приготування мазків, що випускаються різними фірмами.

Фіксація та фарбування мазків крові. Перед забарвленням мазки крові зазвичай фіксують 5-10 хв у метиловому спирті для запобігання гемолізу, який може статися при контакті з водою в процесі фарбування водорозчинною фарбою або при наступному контакті з водою. Методики фіксації описані нижче разом із методиками фарбування. Для фарбування по Райту і Лейшман фіксація не потрібна, так як ці фарби містять метиловий спирт.

Сухі мазки можуть зберігатися протягом 2 днів у сухому теплому місці, у жаркій вологій атмосфері без фіксації вони зберігаються значно менше.

Клітини крові містять базофільні та ацидофільні структури, що відрізняються за реакцією (pH). Ядра є базофільними та забарвлюються у блакитний колір. Високо базофільні (кислі) гранули базофілу також сині. Гемоглобін (будучи основним) забарвлюється ацидофільно, тобто в червоний колір. Забарвлення за допомогою комбінації кислих та основних барвників називається забарвленням за Романовським і має різні модифікації (Паппенгейма, Райта, Нохта, Лейшмана, Гімзи, Джейнера та ін.). Як основний барвник, як правило, використовується метиленовий синій, але також застосовується і толуїдиновий синій. Як кислий барвник використовуються еозин, азур I і азур II.

Критерії гарного забарвлення: рожевий колір еритроцитів, фіолетове забарвлення зернистості нейтрофілів на рожевому фоні, ніжна зернистість азурофільна моноцитів.

Для розведення фарби краще використовувати нейтральну свіжу дистильовану воду. Несвіжа вода, що дистилює, стає кислою через захоплення вуглекислого газу з атмосфери. Якщо дистильована вода має лужну реакцію, еритроцити забарвлюються у брудний блакитно-зелений колір; та частина лейкоцитів, яка повинна фарбуватися блакитним кольором, набуває фіолетового відтінку, гранули еозинофілів стають блакитними і зеленими замість рожевих, а гранули нейтрофілів перефарбовуються. При кислій воді еритроцити забарвлюються в яскраво-жовтогарячий колір, а ядра лейкоцитів дуже бліді. Ідеальною є дистильована вода з pH 7,0, для збереження якої застосовується її забуферування. Можна використовувати готові до вживання буферні таблетки, які розчиняються в дистильованій воді.

Для фарбування мазків кісткового мозку ідеальною є фарба pH 7,4–7,5.

Як уніфіковані прийняті методики забарвлення за Нохтом та Паппенгеймом.

Реактиви для фіксації: 1) метиловий спирт або 2) розчин еозин-метиленового синього по Маю-Грюнвальду.

Реактиви для фарбування мазків по Нохту: 1) основний розчин азура І: 1 г фарби розчиняють у 1 л дистильованої води, залишають у посуді із темного скла на 12-14 днів при кімнатній температурі, після чого використовують; 2) основний розчин еозину калію: 1 г фарби розчиняють у 1 л дистильованої води, залишають у посуді із темного скла на 12-14 днів при кімнатній температурі, після чого використовують; 3) фосфатний буфер (суміш Вейзе), pH 7,4-7,5: змішують 0,49 г дигідрофосфату калію (KH2PO4) та 0,909 г гідрофосфату натрію (Na2HPO4) і розчиняють в 1 л дистильованої води; 4) робочий розчин азур-еозину: перед вживанням змішують 25 мл основного розчину азура II, 20 мл основного розчину еозину калію та 55 мл буферного розчину (пропорції барвників можуть варіювати, їх встановлюють дослідним шляхом при приготуванні свіжих партій основних розчинів).

Реактиви для фарбування мазків за Паппенгеймом: 1) розчин еозин-метиленового синього по Маю-Грюнвальду. За відсутності готового розчину барвника його готують розчиненням 1 г сухої фарби 1 л метилового спирту; 2) робочий розчин азур-еозину за Нохтом.

Фіксація мазків. Фіксуючий розчин наливають у кювету або широкогорлий посуд з притертою пробкою. Мазки поміщають у контейнер, який занурюють у кювету або кладуть по одному в посуд на 5-10 хв. Контейнер зі склом виймають із фіксуючого розчину (або виймають пінцетом скла і встановлюють їх у штативі) і залишають на повітрі до повного висихання.

Забарвлення за Нохтом. Висохлі фіксовані мазки, не виймаючи з контейнера, поміщають у кювету з робочим розчином фарби на певний час (20-45 хв), яке підбирають досвідченим шляхом для кожної партії фарби. За відсутності кювети з контейнером скла поміщають горизонтально на паралельно покладені дві скляні палички (рейки) мазком догори і наливають на них по 3-4 мл робочого розчину фарби. Виймають контейнер зі скла з кювети з барвником і поміщають у кювету з водопровідною водою (при відсутності контейнерів фарбу зі скла змивають водою, не знімаючи їх зі скляних паличок). Мазки висушують на повітрі.

Забарвлення за Паппенгеймом. Сухі нефіксовані мазки крові поміщають у контейнер і опускають у кювету з розчином Травня-Грюнвальда на 3-5 хв (або на нефіксований мазок наливають піпеткою 3-4 мл барвника). Контейнер з мазками обполіскують у кюветі з дистильованою водою, а потім поміщають у кювету з азур-еозиновою фарбою по Нохту на 8-15 хв. На скло, поміщене на «рейки», не зливаючи барвник, додають на 1 хв дистильовану воду, а потім на 8-15 хв наливають на мазок фарбу, потім фарбу змивають водою. Мазки висушують на повітрі.

Забарвлення по Романівському Гімзі. Виготовляється так само, як за Нохтом. Як барвник використовують готовий розчин Романовського-Гімзи, який перед вживанням розводять з розрахунку 1 крапля фарби на 1 мл дистильованої води. Час забарвлення встановлюють дослідним шляхом кожної партії барвника (25–40 хв).

Забарвлення за Райтом. Реактиви. 0,2 г фарби Райта (сухий порошок, BDH/E. Merck) розчиняють у 100 мл метилового спирту та дають постояти кілька днів. Якщо еритроцити фарбуються недостатньо чітко, готують 0,25% або 0,3% розчин.

Хід фарбування. На мазок наносять кілька (приблизно 8) крапель фарби, витримують 2-3 хв (стежать, щоб фарба не висохла), потім наливають на мазок рівну кількість забуференої води. Якщо фарба дозріла, на поверхні фарби з'явиться піна або плівка з металевим блиском. Розведену фарбу залишають на мазку на 2-3 хв, а потім змивають буферним розчином або водою. Не можна допускати, щоб фарба осідала на поверхні мазка. Якщо це сталося, мазок заливають нерозведеною фарбою на 15-20 сек. і потім ще раз буферним розчином або водою.

Приготування буфера фосфатного.

Розчин А (0,2 М КН2PO4): 27,2 г солі розчинити у 1 л дистильованої води.

Розчин Б (0,2 М Na2HPO4): 35,6 г Na2HPO4 × 2Н20 розчинити в 1 л дистильованої води.

Для отримання 100 мл буферного розчину з потрібним pH слід злити розчини А та Б у кількостях, зазначених у таблиці. Величину pH перевіряють за допомогою рН-метра.

Приготування буферного фосфатного розчину

Забарвлення за Лейшманом. Реактиви. 0,15 г сухої фарби Лейшмана розчиняють у 133 мл абсолютного метилового спирту. Фарба повинна повністю розчинитись, бажано попередньо кристали фарби розтерти у ступці. Зберігають фарбу у бутлі зі скляною пробкою, не фільтрують.

Хід фарбування. Здійснюють подібно до забарвлення по Райту, але з подвійним розведенням буферного розчину. Декілька крапель фарби (близько 8) наливають на мазок, витримують 2 хв. Додають подвійну кількість буферного розчину (16 крапель), розмішують похитуванням і залишають на 7-10 хв. Фарбу змивають дистильованою водою за 2-3 секунди. При більш тривалому змиванні фарбування погіршується. Мазки висушують у штативі на повітрі.

Приготування товстої краплі крові. Три краплі крові, нанесені на предметне скло на деякій відстані один від одного, розширюють кутом чистого предметного скла до розміру діаметром приблизно 1 см, маркують олівцем, потім підсушують на повітрі протягом 1-2 год.

Забарвлення товстої краплі крові. Товсті краплі крові не фіксують. Предметне скло з добре просушеними товстими краплями розташовують на «рейках» на деякій відстані один від одного і на 8-10 хв наливають на них робочий розчин азур-еозину по Нохту. Відбувається «вилуговування» еритроцитів. Потім фарбу зливають і на препарати наливають нову порцію робочого розчину азур-еозину по Нохту на 30-35 хв. Після цього предметне скло обережно обполіскують дистильованою водою і висушують.

Автоматичне фарбування мазків

Оскільки однією з найбільш затребуваних функцій у гематологічній лабораторії є приготування та фарбування мазків крові, природні спроби їхньої автоматизації.

Перша автоматична система підготовки мазків була розроблена компанією Sysmex (Японія) ще в 1990 р. і в даний час по всьому світу встановлено понад 1600 систем. Величезний досвід, накопичений за цей період, був використаний при розробці системи нового покоління – повністю автоматизованої станції підготовки та фарбування мазків SP-1000i продуктивністю до 120 мазків на годину. У SP-1000i реалізується високий ступінь стандартизації та якості приготування мазків завдяки використанню інтелектуального клинового методу, який дає можливість користувачу залежно від гематокриту досліджуваної проби регулювати об'єм зразка крові, що наноситься, величину кута розмазуючого леза, швидкість нанесення і час очікування, до 16 різних рівнів регулювання. Забір крові може здійснюватися вручну або автоматично із відкритих чи закритих пробірок. Автоматизована станція підготовки та фарбування мазків SP-1000i компанії Sysmex (Японія)

У системі використовується до семи гнучко настроюваних протоколів фарбування, які дозволяють стандартизувати якість фарбування мазків і задовольнити найвищі вимоги. Можуть бути використані наступні протоколи подвійного та одиночного забарвлення: по Май-Грюнвальду-Гімзі, по Романівському та по Романівському-Гімзі. Мазки крові забарвлюються у виділеній касетній системі, яка містить лише один слайд на касету. При такому способі гарантується хороший взаємозв'язок мазка крові з реагентами, що фарбують, і при цьому не відбувається випаровування метанолу з реагенту в повітря. Для гарантії хорошої фіксації крові перед забарвленням у процес фарбування інтегрований окремий крок щодо попередньої фіксації метанолу.

Завдяки гнучкості протоколу фарбування можна використовувати спеціальний протокол для фарбування кісткового мозку.

Методика виготовлення мазків кісткового мозку для гематологічних досліджень.

Дослідження кісткового мозку – мієлограма Першим питанням, на яке має відповісти дослідження кісткового мозку, є кількісний аспект клітин. Добре відомо, що щодо периферичної крові можна визначити ряд цифрових значень кількості та відсотка різних видів клітин, оскільки вони знаходяться у вільному стані та відносно однорідно поширені у суспензії судинної крові. Зовсім інше можна сказати про кістковий мозку: склад кровотворної тканини дуже різнорідний і розподіл кістковомозкових клітин неоднаковий. Так, пряме числення мієлокаріоцитів в камері коливається в дуже широких межах, як за нормального стану, так і в рамках тієї ж хвороби. Виявлені нами значення в осіб нормі коливалися від 27 000 до 112 000 ядерних елементів на мм3 (Урся). Літературні дані коливаються в ширших межах, їх ліміти становлять 12 000 і 300 000 на мм3 (Cartwright, Page). Після центрифугування в трубці гематокриту виявляються наступні 4 шари: верхній жирний жовтий шар; 2) плазма; 3) сіро-білий шар, утворений з ядерних клітин; 4) червоний шар, що складається з еритроцитів. Вимірювання сіро-білісового шару з ядерних клітин (мієлокріт) представляє обмежене значення або навіть вводить в оману, оскільки виявлені значення у осіб у нормі також дають значні коливання. До того ж, ядерні клітини виявляються не тільки в цьому шарі, але також у жировому та еритроцитному шарах. Але із сріблолесового шару можна приготувати мазки кістковомозкового концентрату після усунення надосадової плазми. Вони довели свою користь у процесі діагностування у випадках, коли прямі мазки бідні клітинами. Враховуючи, що числення в камері мієлокаріоцитів та визначення мієлокриту дають лише приблизні результати з обмеженим відтворенням, ці методи кількісного визначення не є задовільними. Витягуваний при відсмоктує пункції матеріал складає зразок кісткового мозку, змішаного з кров'ю в різній пропорції. Ступінь розведення кісткового мозку кров'ю залежить від низки чинників. Перебіг 32Р довело, що розведення кісткового мозку, що відсмоктується, кров'ю коливається від 40% до 100%. Втім слід зазначити, що дослідження кісткового мозку з метою постановки діагнозу ґрунтується, насамперед, на якісному дослідженні клітинного вмісту, а лише другорядне на кількісні значення цього вмісту. Ось чому кількісні методи визначення кістковомозкових клітин складаються з напівкількісної оцінки клітинного складу кісткового мозку, в порівнянні з нормальними пробами, на: а) мазках з розмозженими грудочками; б) гістологічних зрізах. Дослідження мазка проводиться, в основному, сухим об'єктивом, на декількох мазках, при цьому намічаються такі цілі: а) напівкількісна оцінка кістковомозкової клітинної маси; б) визначення наявності та щільності мегакаріоцитів; в) виявлення гігантських клітин чи гнізд ненормальних клітин; г) ототожнення найбільш підходящих ділянок щодо дослідження шляхом занурення. На мазках, отриманих шляхом розмозження частинок кісткового мозку розрізняються такі три концентричні зони: а) центральна; б) зовнішня; в) проміжна. Центральну зону утворюють жирові вакуолі, клітини строми, гранулоцити та численні зруйновані клітини. Зовнішня зона містить велику кількість крові, яка розріджує кістковомозкові клітини. Подібно до тонких мазків вона сприяє лише дослідженню морфологічних подробиць мієлоїдних клітин та еритроцитів. У проміжній зоні знаходиться найбільш щільна клітинна маса, що допускає оптимальне дослідження, яке може з'ясувати всі питання. Тут кістковомозкові клітини добре збережені та розташовані острівцями або гніздами, саме так, як спостерігається у кістковому мозку. Зберігаючи кістковомозкову топографію результати дослідження цієї зони однорідніші і відповідають фактичному стану кісткового мозку, що підтверджується зіставленням з його гістологічними зображеннями. Напівкількісне визначення клітинної щільності виражається у вигляді: а) нормального, б) багатого або в) мізерного порівняно з нормою кісткового мозку. Виявлення нормальної чи рясної клітинної маси є цінним результатом, тоді як мізерний кістковий мозок слід розглядати з обережністю. Щоб довести наявність фактичної гіпоплазії, слід розглянути кілька пластинок, зробити пункцію в декількох кісткових територіях та/або біопсію кісток. Найбільш точні відомості про кістковомозкову клітинну масу виходять дослідженням гістологічних зрізів. У дорослої людини в нормі відношення простору, який займає жир і активна клітинна паренхіма становить 1: 1 або 2:1. Деякими авторами кістковий мозок розглядається гіпоклітинним, коли кровотворні клітини займають менше чверті кістковомозкових грудочок. Якісне дослідження кісткового мозку є істотним для постановки діагнозу. Воно проводиться за допомогою занурення, як на тонких мазках, так і, зокрема, на мазках з розмозженими грудочками з проміжної зони. Рекомендується відбір найкращих правильно розтягнутих і пофарбованих мазків з морфологічно добре законсервованими клітинами, що чітко виділяються. Це дослідження намічає: а) виявлення різних видів мієлоїдних клітин; б) визначення ступеня дозрівання кожного клітинного ряду; в) уточнення відносин між гранулоцитами та еритробластами (Г/Е);: г) ототожнення клітин на фазі мітозу; д) опис атипових клітин, що зустрічаються. Після дослідження кількох мазків складається або докладна описова «мієлограма» (що містить зроблені, після розшифрування мазків, укладання), або мієлограма у відсотковому відношенні, встановлена ​​не менше 300-500 елементам. Існують два способи складання процентної мієлограми: 1) віднесення інших клітинних рядів до 100 гранулоцитів; 2) відсоткове відображення кожного виду клітин зі всієї кількості кістковомозкових клітин. Зі статистичної точки зору останній метод є більш правильним і мабуть відображає реальну картину клітинного складу кісткового мозку. Встановлені окремими авторами формули значно відрізняються, оскільки важко визначити реальні середні величини в такій різнорідній тканині, як кістковий мозок. У таблиці наведено, за Wintrobe, результати дослідження відібраних кістково-мозкових проб від 12 осіб у нормі. Нормальна мієлограма

Показники мієлограми Середнє значення (%) Межі коливань (%)

Ретикулярні клітини 0,9 0,1-1,6 Недиференційовані бласти 0,6 0,1-1,1 Мієлобласти 1,0 0,2-1,7

Промієлоцити 2,5 1,0-4,1

Мієлоцити нейтрофільні 9,6 7,0-12,2 Метамієлоцитинейтрофільні 11,5 8,0-15,0 Паличкоядерні нейтрофіли 18,2 12,8-23,7 Сегментоядерні нейтрофіли 18,6 13,1-2 Усього клітин нейтрофільного ряду 60,8 52,7-68,9Мієлоцити еозинофільні 0,1 0,0-0,2 Метамієлоцити еозинофільні 0,2 0,1-0,4 Еозинофіли 2,8 0,4-5,2

Усього клітин еозинофіл'ного ряду 3,2 0,5-5,8Мієлоцити базофільні 0,1 0-0,3

Базофіли 0,1 0-0,3

Усього клітин базофільного ряду 0,2 0-0,5Лімфобласти 0,1 0-0,2

Пролімфоцити 0,1 0-0,2

Лімфоцити 8,8 4,3-13,3

Усього клітин лімфоїдного ряду 9,0 4,3-13,7Монобласти 0,1 0-0,2

Моноцити 1,9 0,7-3,1

Плазмобласти 0,1 0-0,2

Проплазмоцити 0,1 0,1-0,2

Плазматичні клітини 09 01-18

Еритробласти 0,6 0,2-1,1

Нормобласти базофільні 3,6 1,4-5,8 Нормобласти поліхроматофільні 12,9 8,9-16,9 Нормобласти оксифільні 3,2 0,8-5,6

Усього клітин еритроїдного ряду 20,5 14,5-26,5Мегакаріоцити 04 02-06

За нашими дослідженнями на здорових людях результати такі:

ряд гранулоцитів 56-70%,

еритробластичний ряд 23-30%, лімфоплазмоцитний ряд 5-10%, моноцитомакрофаговий ряд 1-2% та мегакаріоцитний ряд 0,1-0,8% (Урся). Зміна пропорції нормальних мієлоїдних рядів або їх заміна аномальними клітинами нерідко нагадує вид хвороби. Ретикулярні клітини з'являються рідше і до того ж у невеликій кількості. Цілком випадково на мазках (або на відбитках кісткового мозку) трапляються остеобласти та/або остеокласти, які не слід приймати за неопластичні клітини. Їх наявність частіше відзначається у дітей, рідше у дорослих при первинному мієлофіброзі або вдруге, після карциноматозного метастазу, при гострій лейкемії, остеопорозі та ін. Відношення Г/Е виходить розподілом гранулоцитів на число еритробластів. У дорослого в нормі це відношення становить у середньому 3/1 або 4/1, при цьому межі оцінюються у 2/1 (коли включені лише незрілі гранулоцити) та 5/1 (коли стосується всіх гранулоцитів – зрілих та незрілих). Відношення Г/Е коливається з віком: при народженні невеликий (1,8/1), у 2-тижневому віці підвищується до 11/1, потім поступово знижується, а в однорічних дітей досягає значень дорослої людини. Відношення Г/Е нормальне у випадках глобальної кістковомозкової гіпо-або гіперплазії, так само як і при проліферації окремих клітин, що не входять до розрахунку цього відношення, наприклад, при плазмоцитомі. При лейкеміях, лейкомеподібних реакціях та еритробластопеніях відношення високе, у той час як при анеміях з еритробластичною гіперплазією воно низьке або зворотне (мегалобластична, гемолітична анемія). До видачі даних мієлограми, одержаних після дослідження мазків, необхідно уточнити: а) місце пункції; б) густина кістки; в) умови, в яких відбувалося відсмоктування; г) макроскопічний аспект відібраного матеріалу. Дослідження кісткового мозку – комплексний процес, що ґрунтується на інтеграції численних та різноманітних даних. Його результат повинен відображати висновки загального характеру, що ґрунтуються більше на висновки, ніж на механічну реєстрацію окремих цифр, які, до того ж, вагаються. Висновок будь-якої мієлограми має уточнити або діагноз, або вказівки для додаткових досліджень, які з дослідження кісткового мозку. При захворюваннях крові відсмоктувальна пункція сприяє уточненню діагнозу за допомогою мазків та зрізів із грудочками у 80% випадках. В інших випадках показана кісткова біопсія та гістологічне дослідження кісткового мозку. Біоптичний відбір та гістологічне дослідження видаються необхідними при: а) первинному або вторинному мієлофіброзі; б) кістковомозкової аплазії чи гіпоплазії; в) захворювання, що протікають з ураженнями грануломатозного типу (напр. , хвороба Годжкіна, саркоїдоз, туберкульоз та ін); г) карциноматозному метастазі; д) у всіх випадках, коли відібраний за допомогою пункції матеріал виявляється незадовільним або аспект кісткового мозку не є переконливим. Після біоптичного відбору проби готуються відбитки для проведення цитологічного дослідження, оскільки гістологічні зрізи надають мало відомостей про структурні подробиці кровотворних клітин, що знаходяться в скученому, нерозсіяному та нееталюваному вигляді. До того ж закріплення викликає ретракцію клітин та гістологічне забарвлення менш селективне, ніж цитологічне. Ось чому повне дослідження кісткового мозку передбачає як цитологічне - на мазках або відбитках, так і гістологічне - на зрізах дослідження. Необхідно пам'ятати, що цитологічні та гістологічні методи дослідження кісткового мозку не виключаються, а навпаки взаємодоповнюються: біопсія - кількісний і архітектурний метод, тоді як мієлограма - якісний і цитологічний.

Методика підрахунку формених елементів крові у камері Горяєва.

Методика роботи з гематологічних аналізаторах.

Аналіз торговематологічний- прилад (комплекс обладнання), призначений для проведення кількісних досліджень клітин кровіу клініко-діагностичних лабораторіях. Може бути автоматичним або напівавтоматичним. Напівавтоматичний гематологічний аналізатор від автоматичного відрізняється тим, що процес розведення проби крові здійснюється окремим приладом – дилютером. Після приготування розведення цільної крові оператор повинен перенести розведену пробу модуль вимірювання. Нині напівавтоматичні аналізатори мало випускаються.

Автоматичний гематологічний аналізатор є повністю автоматизованим приладом, в якому весь аналітичний процес виконується автоматично.

Сучасні автоматичні аналізатори здатні обробляти десятки зразків (від 60 до 120) на годину, з відповідною специфікацією точністю та відтворюваністю, а також зберігати результати тестів у вбудованій пам'яті та, при необхідності, роздруковувати їх на вбудованому термопринтері або зовнішньому принтері.

Сучасні гематологічні аналізатори класифікуються за номенклатурою визначених показників клітин крові.

Восьми-параметрові гематологічні аналізаторивизначають такі параметри: концентрації еритроцитів(RBC), лейкоцитів(WBC), тромбоцитів(Plt), гемоглобіну(Hb), а також такі параметри еритроцитів: середній обсяг еритроцитів (MCV), середній вміст гемоглобіну в еритроцитах (MCH), середню концентрацію гемоглобіну в еритроцитах (MCHC), гематокрит(Hct).

Восьми параметрові гематологічні аналізатори нині практично не виробляються.

Гематологічні аналізатори класу 3-диф. Гематологічні аналізатори класу 3-диф, залежно від моделі, дозволяють визначати від 16 до 22 показників клітин крові. Аналізатори цього класу, крім тих параметрів, які визначають восьмипараметровые аналізатори визначають три субпопуляції лейкоцитів: концентрації лімфоцитів (Lm), гранулоцитів (Gr) і, так званих середніх лейкоцитів (Mid), а також їх процентний вміст Lm%, Gr% і Mid%. Звідси назва класу 3-диф. Крім цього, гематологічні аналізатори цього класу визначають коефіцієнт варіації обсягу еритроцитів (RDW) і ряд показників, що характеризують тромбоцити: середній обсяг тромбоцитів (MPV), частку обсягу тромбоцитів (Tct) (аналог гематокриту), коефіцієнт варіації обсягу тромбоцитів (PD).

Важливою діагностичною інформацією, що дозволяє отримати гематологічні аналізатори цього класу, є функції розподілу за обсягом еритроцитів, лейкоцитів та тромбоцитів – гістограми.

Гематологічні аналізатори класу 5-диф.Основним вирізненням гематологічних аналізаторів 5-диф від аналізаторів 3-диф є їх здатність визначати всі 5 субпопуляцій лейкоцитів: лімфоцити (Lym), моноцити (Mon), нейтрофіли (Neu), базофіли (Bas) та еозинофіли (Eos), а також вміст Lym%, Mon%, Neu%, Bas% та Eos%. Імпедансний метод підрахунку, відомий також як лічильник Коултера, що застосовується в аналізаторах 3-диф, не в змозі розрізнити нейтрофіли, базофіли та еозинофіли, тому в аналізаторах 5-диф застосовується інший метод диференціювання клітин. Він заснований на принципі дифракціїлазерного випромінювання на клітинах лейкоцитів та подальшому аналізі розсіяного випромінювання. "Середні" лейкоцити не відрізняються за розміром настільки, щоб розрізняти їх імпедансним методом, але мають різну внутрішню структуру і по-різному взаємодіють з барвниками. А метод детектування дифракційної картини виявляється чутливим до внутрішньої структури клітин. Таким чином еритроцити та тромбоцити підраховуються лічильником Коултера, а лейкоцити окремим лазерним блоком.

Розрахунок рН буферних розчинів здійснюється за рівнянням Гендерсона – Гассельбаха:

– для кислотного буфера рівняння має вигляд

– для основного буфера

Рівняння показують, що рН буферного розчину даного складу визначається ставленням концентрацій кислоти та солі або основи та солі, тому не залежить від розведення. При зміні об'єму розчину концентрація кожного компонента змінюється в однакове число разів.

Буферна ємність

Здатність буферних розчинів зберігати сталість рН обмежена. Тобто. додавати кислоту або луг, суттєво не змінюючи рН буферного розчину, можна лише в обмежених кількостях.

Величину, що характеризує здатність буферного розчину протидіяти зміщенню реакції середовища при додаванні кислот та лугу, називають буферною ємністю розчину (В).

Буферна ємність вимірюється кількістю молей еквівалентів сильної кислоти або лугу, додавання якої до 1 л буферного розчину змінює рН на одиницю.

Математично буферна ємність визначається так:

В за кислотою (моль/л або ммоль/л):

,

де n(1/z HA) – кількість моль еквівалентів кислоти, рН 0 та рН – рН буферного розчину до та після додавання кислоти, V Б – обсяг буферного розчину.

По лугу (моль/л або ммоль/л):

,

де n (1/z ВОН) – кількість моль еквівалентів лугу, інші позначення ті самі.

Буферна ємність залежить від ряду факторів:

1. Від природи речовин і компонентів буферного розчину, що додаються. Т.к. деякі речовини можуть утворювати нерозчинні сполуки чи комплекси чи давати інші небажані реакції з компонентами буферної системи, тоді поняття буферної ємності втрачає сенс.

2. Від початкової концентрації компонент буферної системи.

Чим більша кількість компонентів кислотно-основної пари в розчині, тим більша буферна ємність цього розчину.

Межа співвідношення концентрацій компонентів буферного розчину, у якому система досі зберігає свої властивості. Інтервал рН = рК ± 1 називається зоною буферної дії системи. Це відповідає інтервалу співвідношення З солі /З к-ти від 1/10 до 10/1.

В к (крові) = 0,05 моль/л; К (плазми) = 0,03 моль/л; В к (сив.крові) = 0,025 моль/л

Буферні системи крові

Особливо велике значення буферні системи мають у підтримці кислотно-основної рівноваги організмів. Значення рН переважно внутрішньоклітинних рідин знаходиться в інтервалі від 6,8 до 7,8.

Кислотно – основна рівновага в крові людини забезпечується гідрокарбонатною, фосфатною, білковою та гемоглобіновою буферними системами. Нормальне значення рН плазми 7,40 ± 0,05.

Гемоглобінова буферна система на 35% забезпечує буферну ємність крові: . Оксигемоглобін є сильнішою кислотою, ніж відновлений гемоглобін. Оксигемоглобін зазвичай буває у вигляді калієвої солі.

Карбонатна буферна система : за своєю потужністю посідає перше місце. Вона представлена ​​вугільною кислотою (Н 2 3) і бікарбонатом натрію або калію (NaНСО 3 , КНСО 3) у пропорції 1/20. Бікарбонатний буфер широко використовується для корекції розладів кислотно-основного стану організму.

Фосфатна буферна система . Дигідрофосфато володіє властивостями слабкої кислоти і взаємодіє з лужними продуктами, що надійшли в кров. Гідрофосфат має властивості слабкого лугу і вступає в реакцію з сильнішими кислотами.

Білкова буферна система здійснює роль нейтралізації кислот і лугів завдяки амфотерним властивостям: у кислому середовищі білки плазми поводяться як основи, в основній – як кислоти:

Буферні системи є й у тканинах, що сприяє підтримці рН тканин щодо відносно постійному рівні. Головними буферами тканин є білки та фосфати. Підтримка рН здійснюється також за допомогою легень та нирок. Через легені видаляється надлишок вуглекислоти. Нирки при ацидозі виділяють більше кислого одноосновного фосфату натрію, а при алкалозі більше лужних солей: двоосновного фосфату натрію і бікарбонату натрію.

Приклади розв'язання задач

Рішення:

Розраховуємо рН кислотного буферного розчину за формулою

Відповідь: 5,76

Рішення:

Розраховуємо буферну ємність за формулою:

Відповідь: 0,021 моль/л

приклад 3.

Буферний розчин складається із 100 мл 0,1моль/л оцтової кислоти та 200 мл 0,2моль/л ацетату натрію. Як зміниться рН цього розчину, якщо до неї додати 30 мл 0,2 моль/л розчину гідроксиду натрію.

Рішення:

Розраховуємо рН буферного розчину за формулою:

При додаванні до буферного розчину NaOH збільшується кількість солі та зменшується кількість кислоти в буферному розчині:

0,006 0,006 0,006

СH 3 COOH + NaOH = CH 3 COONa + H 2 O

Розраховуємо n (NaOH) = 0,03 л · 0,2 моль/л = 0,006 моль, отже у буферному розчині кількість кислоти зменшується на 0,006 моль, а кількість солі збільшиться на 0,006 моль.

Розраховуємо рН розчину за формулою:

Звідси: рН 2 – рН 1 = 5,82 – 5,3 = 0,52

Відповідь:зміна рН буферного розчину = 0,52.

Завдання для самостійного вирішення

4. На титрування 2 мл крові для зміни рН від початкового значення (7,36) до кінцевого значення (7,0) потрібно додати 1,6 мл 0,01 М розчину HCl. Розрахуйте буферну ємність за кислотою.

5. Скільки моль ацетату натрію необхідно додати до 300 мл оцтової кислоти, щоб знизити концентрацію іонів водню в 300 разів (Д дис (сн 3 соон) = 1,85.10 -5).

6. При біохімічних дослідженнях використовують фосфатний буфер із рН= 7,4. У якому співвідношенні треба змішати розчини гідрофосфату натрію та дигідрофосфату натрію з концентрацією по 0,1 моль/л кожен, щоб отримати такий буферний розчин (рК(Н 2 РО 4 -) = 7,4).

7. Які порушення КОС спостерігаються за наступних показників: рН крові = 7,20, Рсо 2 = 38 мм рт. ст., БО = 30 ммоль/л, СБО = -4 ммоль/л. Як усунути це порушення КОС?

Тестові завдання

Фосфатно-сольовий промивний буфер з Твін-20 для імуногістохімії - це концентрат (20х), який після розведення використовується для промивання стекол від реагентів та короткочасного зберігання імуногістохімічних зразків між процедурами. Після розведення готовий до застосування 0,01 М розчин має рН 7,4±0,1. Використання даного фосфатно-сольового буфера дозволяє не тільки забезпечити якісне промивання, але й зберегти морфологічні характеристики антитіл та їх епітопів, що застосовуються, що полегшує специфічне зв'язування, необхідне для імуногістохімічної реакції. Додавання Твін-20 до фосфатно-сольового буфера сприяє більш ефективному промиванню та запобігає появі неспецифічного фарбування.

Наші переваги:

На даний момент ми співпрацюємо із провідними зарубіжними виробниками лабораторних реактивів. Нашими клієнтами є як недержавні, і державні установи, зокрема медичні організації Москви та інших міст Росії. Для постійних клієнтів передбачено систему знижок.